聚乙二醇修飾對(duì)蛋白質(zhì)的脫酰胺與二硫鍵的影響研究.pdf

1、蛋白質(zhì)藥物因其具有高活性、特異性強(qiáng)和生物功能明確等特點(diǎn)使其應(yīng)用日益廣泛，但蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性使其在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過程中常出現(xiàn)脫酰胺降解、二硫鍵錯(cuò)配以及聚集形成沉淀等現(xiàn)象，造成蛋白質(zhì)的活性損失甚至產(chǎn)生一定的副作用，降低了其臨床使用效果。本文以重組人血管內(nèi)皮抑制素和重組人粒細(xì)胞集落刺激因子為模型蛋白，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)酶解技術(shù)研究了蛋白質(zhì)儲(chǔ)存過程中發(fā)生的脫酰胺過程及二硫鍵變化，繼而對(duì)二者進(jìn)行PEG修飾，重點(diǎn)考察PEG修飾對(duì)蛋白質(zhì)儲(chǔ)

2、存過程中脫酰胺與二硫鍵的影響。
　　 本文從三個(gè)方面對(duì)藥用蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性開展了研究探索。首先，系統(tǒng)研究了重組人血管內(nèi)皮抑制素在不同儲(chǔ)存條件下天冬酰胺的脫酰胺變化，結(jié)果表明該蛋白序列中與Gly相連的Asn127在儲(chǔ)存過程發(fā)生了脫酰胺反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)研究不同條件下Asn127脫酰胺過程的動(dòng)力學(xué)并系統(tǒng)考察了不同pH和溫度下脫酰胺過程動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)選擇的條件下脫酰胺過程隨pH與溫度的升高，反應(yīng)速率加快。
　　 其次，研

3、究了重組人粒細(xì)胞集落刺激因子中的二硫鍵連接方式及其對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，蛋白酶解產(chǎn)物中檢測(cè)出分子間二硫鍵Cys18-Cys18及錯(cuò)配的二硫鍵Cys18-Cys37、Cys18-Cys65或Cys37-Cys75。蛋白濃度從0.5 mg/mL增加到1.0 mg/mL、1.52 mg/mL，分子間二硫鍵Cys18-Cys18的含量在其濃度基礎(chǔ)上依次增加15.25％、105.08％，表明分子間二硫鍵在一定范圍內(nèi)受濃度影響，濃度增加可加劇其形成

4、過程。檢測(cè)出含分子間二硫鍵的多肽(MW15710 Da)，該多肽含量隨濃度的增加減少且該過程伴隨沉淀產(chǎn)生，證明了蛋白質(zhì)沉淀過程與分子間二硫鍵形成密切相關(guān)。
　　 第三部分主要研究了PEG修飾對(duì)蛋白質(zhì)脫酰胺過程和二硫鍵的影響。采用mPEG-ALD(20 kDa)對(duì)原蛋白進(jìn)行修飾，利用蛋白質(zhì)酶解技術(shù)結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)研究了修飾前后多肽含量的變化并確定修飾位點(diǎn)；研究了PEG修飾對(duì)脫酰胺及二硫鍵的影響，考察了脫酰胺速率常數(shù)，結(jié)果表明修飾后