聚乙二醇修飾對牛乳β-乳球蛋白的致敏性與構(gòu)象變化的研究.pdf

1、聚乙二醇修飾技術(shù)(PEGylation)是20世紀(jì)七十年代中后期發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),通過修飾可以使蛋白藥物的抗原性降低或消除、增加水溶性、提高穩(wěn)定性等一系列優(yōu)點(diǎn)。本課題研究了PEG修飾對β-乳球蛋白致敏性和構(gòu)象變化的影響,初步探討了β-乳球蛋白致敏性與構(gòu)象變化之間的關(guān)系。
　　 導(dǎo)致牛乳過敏的主要過敏原之一為β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg),消除主要致敏原β-乳球蛋白的致敏性始終是國內(nèi)外乳制品加工技術(shù)研

2、究的熱點(diǎn)之一。本文以mPEG-SC(20kDa)修飾β-乳球蛋白,通過間接競爭ELISA研究修飾產(chǎn)物抗原性的變化,結(jié)果表明:修飾反應(yīng)時間對β-Lg抗原性降低的效果影響最大,最佳反應(yīng)條件即修飾反應(yīng)溶液pH7.0、反應(yīng)時間8h、mPEG-SC與β-Lg物質(zhì)的量比3:1時的抗原性為53.64μg/mL(初始值為180μg/mL),抗原性降低率為70.20％;SDS-PAGE得到PEG修飾β-Lg的產(chǎn)物有兩種:兩點(diǎn)修飾產(chǎn)物(di-PEGylat

3、edβ-Lg,58 kDa)和三點(diǎn)修飾產(chǎn)物(tri-PEGylatedβ-Lg,78 kDa)。通過陽離子交換層析法(樹脂為SP Sepharose Fast Flow)分離純化PEG修飾β-乳球蛋白后的產(chǎn)物,收集洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)得到純化的產(chǎn)物為兩點(diǎn)修飾產(chǎn)物、三點(diǎn)修飾產(chǎn)物。修飾產(chǎn)物的熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PEGylation過程中發(fā)生熒光淬滅的現(xiàn)象,導(dǎo)致β-Lg的三、四級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,同時β-Lg抗原性的降低伴隨著相對熒

4、光強(qiáng)度的降低。圓二色譜分析結(jié)果表明,PEGylation過程中,從β-Lg到di-PEGylatedβ-Lg,再到tri-PEGylatedβ-Lg,β-sheet含量逐漸增加(β-sheet含量:β-Lg33.2%,di-PEGylatedβ-Lg35.7%,tri-PEGylatedβ-Lg44.6%);隨著結(jié)合到β-Lg分子上PEG分子的增加,α-helix從14.3%到14.9%,再到19.2%,表明α-helix略有增加。