精氨酸脫亞胺酶位點突變對聚乙二醇修飾的影響研究.pdf

1、目的：對野生型ADI(wADI)進行定點突變改造，構(gòu)建突變型ADI(mADI)大腸桿菌重組表達系統(tǒng)，篩選出高表達的重組工程菌。建立重組mADI的發(fā)酵工藝和純化工藝。對比分析位點突變對酶活性的影響。對野生型和突變型ADI進行PEG修飾和純化，對比分析位點突變對PEG修飾ADI的影響。
　　方法：⑴ADI突變位點的設計與構(gòu)建表達：根據(jù)支原體來源的野生型ADI蛋白序列設計大腸桿菌密碼偏愛性的突變型 ADI基因序列并對其全基因合成。將全基

2、因合成的mADI插入到pET-3a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-3a-mADI；重組質(zhì)粒pET-3a-mADI轉(zhuǎn)化至表達宿主菌 E.coli BL21(DE3)，采用抗性篩選法獲得重組工程菌；搖瓶表達篩選高表達菌株并進行30L體系放大發(fā)酵表達。⑵ADI的純化工藝和酶活性研究：通過高壓勻漿法破菌、包涵體洗滌、稀釋復性、DEAE陰離子交換層析、Butyl疏水層析等工藝獲得純的目的蛋白；對純化后的wADI和mADI分別進行紫外法測活，對比分析位點突變

3、對酶活性的影響。⑶ADI的PEG修飾研究：采用PEG-5k對兩種酶進行不同比例的修飾；采用分子篩法對修飾后的樣品進行純化，獲得高純度的修飾樣品；采用SEC-HPLC/UV-RI紫外示差聯(lián)用法測定平均修飾度，體外測活法對修飾樣品測活，對比分析位點突變對PEG修飾ADI的影響。
　　結(jié)論：經(jīng)雙酶切和基因測序法對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行檢測，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒 pET-3a-mADI，目的基因在大腸桿菌中以包涵體形式表達，表達量高達30％

4、。建立并確定了mADI的搖瓶表達和發(fā)酵罐放大培養(yǎng)條件。探索并建立了穩(wěn)定的純化工藝，SDS-PAGE和HPLC純度都高于95%以上。經(jīng)體外測活對比分析，突變位點未對酶活性產(chǎn)生明顯的影響。成功實現(xiàn)wADI和mADI不同摩爾比例的PEG修飾，并通過純化獲得各自單一的修飾產(chǎn)物。對比分析這兩種酶進行 PEG修飾前后的差異和相關性（PEG修飾個數(shù)的差異，修飾位點的差異、酶活性差異等），證明了突變位點會影響PEG與精氨酸脫亞胺酶結(jié)合，在wADI相應的