產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶變形假單胞菌的篩選鑒定及酶的定向改造.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase, ADI，EC3.5.3.6)，屬于一類稱為“胍基修飾酶”總科，催化精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸和氨。該酶廣泛存在于多種微生物中，但哺乳類動物細胞中沒有該種酶。因其具有的成為精氨酸缺陷型腫瘤如肝細胞瘤、黑色素瘤抗癌藥物的巨大潛力而被研究。
　　 肝細胞癌是現(xiàn)在世界上病發(fā)率最高的癌癥之一，每年新增一百萬病例。近年來，精氨酸脫亞胺酶(ADI)的抗癌活性在國際上受到關(guān)注。美國食品藥品管理局(F

2、DA)，歐洲藥品審評署(EMEA)分別于1999年及2005年通過ADI-PEG-20作為罕見病藥物用于治療黑素瘤，肝細胞癌，目前三期臨床正在進行中。本研究室通過篩選鑒定ADI產(chǎn)生菌株，并對該酶進行定向改造以改良其在體內(nèi)生理條件下的酶活和酶學性質(zhì)，為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥提供酶源。
　　 通過建立一種ADI產(chǎn)生菌的篩選方法，得到一株產(chǎn)ADI的菌株SWP1。對該菌進行形態(tài)、生理生化特征鑒定和16SrRNA基因序列分析，鑒定

3、該菌為變形假單胞菌。該菌現(xiàn)保藏于中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保存號CGMCC No.2039，并己申請專利(一株產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及其應(yīng)用，專利號：200710107822.X)。
　　 構(gòu)建ADI編碼基因arcA的重組表達載體pET24a-ADI，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效表達。通過對誘導表達條件的優(yōu)化，確定在OD600達到1.0時加入0.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖

4、苷(IPTG),30℃誘導4h時酶活最高，為2.04U/mL發(fā)酵液。重組精氨酸脫亞胺酶(rADI)經(jīng)離子交換層析和凝膠過濾層析后，得到電泳純的rADI。比酶活為20.85U/mg(pH6.0，37℃)，Km為2.88mmol/L，Vmax為31.68μmol/min/mg，最適反應(yīng)pH6.0。經(jīng)凝膠過濾分析，該酶分子量為92.6kDa，SDS-PAGE電泳顯示ADI條帶大小為46kDa，說明重組精氨酸脫亞胺酶為同源二聚體。
　　

5、 研究表明，來源于變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039的重組ADI的最適反應(yīng)pH為6.0，在pH7.4（人體內(nèi)生理pH在7.4左右）時殘余酶活降低至10％以下；其Km（2.88mmol/L，pH6.0），高于人血清精氨酸濃度(100-120μM)20倍以上。因此，該精氨酸脫亞胺酶的高Km值及生理pH條件下酶活較低的性質(zhì)成為該酶抗癌活性研究的限制性因素。定向進化技術(shù)是改造分子朝既定目標進化

6、的有力手段?；诟牧嫉亩阴Ｒ浑苛虬冯澹y定瓜氨酸）方法，建立了簡便靈敏的96孔板高通量篩選模型，用于獲得生理pH條件下具有高酶活和低Km值的精氨酸脫亞胺酶。通過一輪易錯PCR，從650個突變株中篩選獲得一株優(yōu)良的突變株M314，其生理pH條件下比酶活(9.02U/mg)較出發(fā)菌株(0.44U/mg)提高20倍以上，Km值下降至0.65mmol/L(pH7.4)，最適pH從6.0提高至6.5。M314攜帶的三個突變位點分別為A128T,