假單胞菌精氨酸脫亞胺酶的發(fā)酵制備與活性研究.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶(argininedeiminase，簡稱ADI)途徑每分解一分子精氨酸可產(chǎn)生一分子ATP，是一些微生物的主要能量來源。ADI催化該途徑中的第一步反應(yīng)，即將精氨酸降解為瓜氨酸和氨氣。對(duì)于人類而言精氨酸屬于非必需氨基酸，正常的細(xì)胞核組織可通過瓜氨酸在精氨酸-琥珀酸(ASS)合成酶下作用下合成，而一些人類癌細(xì)胞不表達(dá)ASS，從而不能從瓜氨酸合成精氨酸。因此，精氨酸脫亞胺酶有可能從根本上消滅或控制精氨酸缺陷型腫瘤，如黑色素癌和肝

2、癌等。 以往在ADI的制備中，多采用的是支原體(Mycoplasmaarginini)，在生物安全性方面存在一定的隱患。采用本實(shí)驗(yàn)室自行篩選的假單胞菌(Pseudomonas)制備ADI，使用優(yōu)化后培養(yǎng)基，葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨4g/L，精氨酸鹽酸鹽8g/L，初始pH7.0，接種量4％，裝液量60/250mL搖瓶，轉(zhuǎn)速190rpm，培養(yǎng)溫度30℃，24h后單位發(fā)酵液酶活由優(yōu)化前的1.34U/mL提高到1.82U

3、/mL，提高35％；在5L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)中，酶活上升至2.17U/mL，提高57％，達(dá)到了良好的產(chǎn)酶效果。 經(jīng)過硫酸銨鹽析、透析、DEAESephadexA-50離子交換層析和SephadexG-75凝膠過濾層析等一系列手段純化ADI，純化后的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)為單一條帶，分子量約為54kDa。最終ADI酶活得率為5.8％，提純倍數(shù)為11.0，比酶活為5.28U/mg。 初步驗(yàn)證了ADI的體內(nèi)和體外的抗癌活性