銅綠假單胞菌裂解性噬菌體的篩選、鑒定及應(yīng)用.pdf

1、水貂是世界上最重要的毛皮動(dòng)物品種。水貂養(yǎng)殖廣泛分布于北美、北歐、俄羅斯、阿根廷、烏克蘭以及中國等國家。隨著集約化、規(guī)?；潭鹊奶岣?，在降低養(yǎng)殖成本的同時(shí)，高密度養(yǎng)殖也帶來了細(xì)菌性疾病的蔓延傳播，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，由銅綠假單胞菌引起的出血性肺炎，死亡率較高，是水貂養(yǎng)殖過程中一種重要的細(xì)菌傳染性疾病。
　　噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，是自然界分布最廣的一種生物類群，具有存在廣泛、研發(fā)時(shí)間短、成本低;增殖快;安全有效;

2、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，作為抗生素的替代品，具有廣闊的研發(fā)前景。近年來，抗生素的過量使用以及超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，噬菌體作為抗菌制劑的研發(fā)又開始受到國內(nèi)外專家的普遍關(guān)注，并相繼有一些在食品加工過程中控制食源性致病菌的噬菌體制劑產(chǎn)品面市。本論文以水貂源銅綠假單胞菌為宿主，分離其裂解性噬菌體，研究應(yīng)用噬菌體對(duì)水貂出血性肺炎的控制作用。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.采集出血性肺炎水貂的肺部樣品，使用銅綠假單胞菌選擇性培養(yǎng)基，分離得到5株銅綠假單胞菌

3、疑似菌株，經(jīng)生理生化指標(biāo)及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，PA1-1、PA5-1-1、PA5-1-2、PA5-2-1、PA5-2-25株菌株分別均為銅綠假單胞菌，其16S rDNA序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)分別為KF977856、KF977857、KF977858、KF977859和KF977860;根據(jù)K-B法操縱規(guī)程和判斷標(biāo)準(zhǔn)，分析銅綠假單胞菌分離株的耐藥性，使用酶聯(lián)免疫法檢測外毒素A水平，結(jié)果顯示，與2002年銅綠假

4、單胞菌菌株相比，2012年分離得到的銅綠假單胞菌菌株對(duì)國內(nèi)水貂養(yǎng)殖場普遍使用的慶大霉素和多粘菌素耐藥性增強(qiáng)，外毒素A表達(dá)水平顯著提高。
　　2.采用絲裂霉素C誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)銅綠假單胞菌菌株P(guān)A0205、PA5-1-1為非溶源性細(xì)菌;以PA0205和PA5-1-1銅綠假單胞菌為宿主，采用雙層平板法從醫(yī)院廢水中分離得到PPA0205和PPA-ABTNL2株噬菌體;透射電鏡觀察噬菌體的形態(tài)，表明PPA0205屬長尾噬菌體科，PPA-AB

5、TNL屬短尾噬菌體科;宿主譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，噬菌體PPA-ABTNL可以裂解15株銅綠假單胞菌中的14株，而噬菌體PPA0205可以裂解15株銅綠假單胞菌中的2株，PPA-ABTNL宿主譜較寬;一步生長曲線測定結(jié)果顯示，噬菌體PPA0205和PPA-ABTNL的潛伏期分別為30 min和25 min，裂解期分別為40 min和35 min，裂解量分別為70 PFU/infected cell和115 PFU/infected cell;

6、pH(3～9)以及溫度(-20℃～65℃)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與噬菌體PPA0205比較，噬菌體PPA-ABTNL穩(wěn)定性較好，耐受pH和溫度的變化;體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPA0205和PPA-ABTNL在6-7 h內(nèi)能夠控制各自宿主的增殖，而PPA-ABTNL抑菌效果較好。
　　3.在氯化銫密度梯度介質(zhì)中，采用超速離心的方法純化噬菌體，提取噬菌體PPA-ABTNL的基因組，進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明PPA-ABTNL基因

7、組大小為43227 bp，G+C含量為62.4％;共編碼54個(gè)ORF;基因組可分為宿主反轉(zhuǎn)區(qū)、DNA復(fù)制區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，RNA聚合酶位于結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)前;比較基因組學(xué)顯示，PPA-ABTNL與phiKMV屬噬菌體phiKMV、LKD16、LUZ19基因組結(jié)構(gòu)上存在高度的相似性;系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，PPA-ABTNL噬菌體DNA聚合酶、RNA聚合酶、衣殼蛋白編碼基因與phiKMV屬噬菌體具有同源性，且相似性較高;跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示，穿

8、孔素蛋白氨基酸序列含有跨膜區(qū)，其中28-50氨基酸為跨膜的α-螺旋結(jié)構(gòu)，跨膜區(qū)疏水氨基酸比例為69.6％;調(diào)控元件分析結(jié)果表明，基因組編碼4個(gè)宿主啟動(dòng)子、3個(gè)噬菌體本身啟動(dòng)子和3個(gè)不依賴于ρ-因子的終止子。聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜分析證實(shí)，ORF38和ORF42分別編碼衣殼蛋白和注射尾針蛋白，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，PPA-ABTNL屬于phiKMV屬，且不含有連接酶、轉(zhuǎn)座酶及毒素蛋白編碼基因，是裂解性噬菌體，可用于噬菌

9、體治療研究。
　　4.連續(xù)3d采用滴鼻方式施用噬菌體粗制液20μL(1012 PFU/mL·d)，7d后取BALB/c小鼠肺臟、肝臟HE染色，與生理鹽水組相比較，噬菌體組小鼠肺臟、肝臟出現(xiàn)輕微炎癥反應(yīng)，但無異常行為表現(xiàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證明噬菌體粗制液的安全性以及超聲噴霧對(duì)噬菌體效價(jià)無顯著影響的基礎(chǔ)上，采用超聲噴霧的方式，施用噬菌體治療水貂出血性肺炎實(shí)驗(yàn)，具體方法為:實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組水貂鼻腔接種108 PFU的銅綠假單胞菌，2h后在1

10、20 cm×50 cm×40 cm的密閉容器內(nèi)，使用超聲噴霧器施用不同濃度的噬菌體3 min(流量為3ml/min)，在噬菌體施用后，再額外持留3 min。24 h后檢測水貂肺部的銅綠假單胞菌數(shù)量和噬菌體效價(jià)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組(n=8)相比，MOI=1、10、100噬菌體處理組(n=8)銅綠假單胞菌數(shù)量分別降低了5.08％(P＞0.05)、19.42％.(P＜0.05)和26.13％(P＜0.05)，噬菌體效價(jià)分別為3.33 PFU/

11、g(P＞0.05)、293.00 PFU/g(P＜0.05)和13593.67 PFU/g(P＜0.05)。在12d的實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，與對(duì)照組相比，MOI=1、10、100噬菌體處理組存活率分別為20％(P＞0.05)、80％(P＜0.05)和100％(P＜0.05)。綜合以上分析可見，在30 dm3/只水貂的空間內(nèi)，采用超聲噴霧的方式施用MOI=10的噬菌體PPA-ABTNL，可控制水貂的出血性肺炎。
　　綜上所述，本研究針對(duì)引起水貂