銅綠假單胞菌裂解性噬菌體的篩選、鑒定及應用.pdf

1、水貂是世界上最重要的毛皮動物品種。水貂養(yǎng)殖廣泛分布于北美、北歐、俄羅斯、阿根廷、烏克蘭以及中國等國家。隨著集約化、規(guī)?；潭鹊奶岣?，在降低養(yǎng)殖成本的同時，高密度養(yǎng)殖也帶來了細菌性疾病的蔓延傳播，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。其中，由銅綠假單胞菌引起的出血性肺炎，死亡率較高，是水貂養(yǎng)殖過程中一種重要的細菌傳染性疾病。
　　噬菌體是感染細菌的病毒，是自然界分布最廣的一種生物類群，具有存在廣泛、研發(fā)時間短、成本低;增殖快;安全有效;

2、無殘留等優(yōu)點，作為抗生素的替代品，具有廣闊的研發(fā)前景。近年來，抗生素的過量使用以及超級細菌的出現(xiàn)，噬菌體作為抗菌制劑的研發(fā)又開始受到國內(nèi)外專家的普遍關注，并相繼有一些在食品加工過程中控制食源性致病菌的噬菌體制劑產(chǎn)品面市。本論文以水貂源銅綠假單胞菌為宿主，分離其裂解性噬菌體，研究應用噬菌體對水貂出血性肺炎的控制作用。具體實驗內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.采集出血性肺炎水貂的肺部樣品，使用銅綠假單胞菌選擇性培養(yǎng)基，分離得到5株銅綠假單胞菌

3、疑似菌株，經(jīng)生理生化指標及16S rDNA分子生物學鑒定，PA1-1、PA5-1-1、PA5-1-2、PA5-2-1、PA5-2-25株菌株分別均為銅綠假單胞菌，其16S rDNA序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為KF977856、KF977857、KF977858、KF977859和KF977860;根據(jù)K-B法操縱規(guī)程和判斷標準，分析銅綠假單胞菌分離株的耐藥性，使用酶聯(lián)免疫法檢測外毒素A水平，結(jié)果顯示，與2002年銅綠假

4、單胞菌菌株相比，2012年分離得到的銅綠假單胞菌菌株對國內(nèi)水貂養(yǎng)殖場普遍使用的慶大霉素和多粘菌素耐藥性增強，外毒素A表達水平顯著提高。
　　2.采用絲裂霉素C誘導實驗，證實銅綠假單胞菌菌株PA0205、PA5-1-1為非溶源性細菌;以PA0205和PA5-1-1銅綠假單胞菌為宿主，采用雙層平板法從醫(yī)院廢水中分離得到PPA0205和PPA-ABTNL2株噬菌體;透射電鏡觀察噬菌體的形態(tài)，表明PPA0205屬長尾噬菌體科，PPA-AB

5、TNL屬短尾噬菌體科;宿主譜實驗結(jié)果顯示，噬菌體PPA-ABTNL可以裂解15株銅綠假單胞菌中的14株，而噬菌體PPA0205可以裂解15株銅綠假單胞菌中的2株，PPA-ABTNL宿主譜較寬;一步生長曲線測定結(jié)果顯示，噬菌體PPA0205和PPA-ABTNL的潛伏期分別為30 min和25 min，裂解期分別為40 min和35 min，裂解量分別為70 PFU/infected cell和115 PFU/infected cell;

6、pH(3～9)以及溫度(-20℃～65℃)穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，與噬菌體PPA0205比較，噬菌體PPA-ABTNL穩(wěn)定性較好，耐受pH和溫度的變化;體外抑菌實驗結(jié)果顯示，PPA0205和PPA-ABTNL在6-7 h內(nèi)能夠控制各自宿主的增殖，而PPA-ABTNL抑菌效果較好。
　　3.在氯化銫密度梯度介質(zhì)中，采用超速離心的方法純化噬菌體，提取噬菌體PPA-ABTNL的基因組，進行測序和生物信息學分析。結(jié)果表明PPA-ABTNL基因

7、組大小為43227 bp，G+C含量為62.4％;共編碼54個ORF;基因組可分為宿主反轉(zhuǎn)區(qū)、DNA復制區(qū)和結(jié)構蛋白編碼區(qū)，RNA聚合酶位于結(jié)構蛋白編碼區(qū)前;比較基因組學顯示，PPA-ABTNL與phiKMV屬噬菌體phiKMV、LKD16、LUZ19基因組結(jié)構上存在高度的相似性;系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，PPA-ABTNL噬菌體DNA聚合酶、RNA聚合酶、衣殼蛋白編碼基因與phiKMV屬噬菌體具有同源性，且相似性較高;跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示，穿

8、孔素蛋白氨基酸序列含有跨膜區(qū)，其中28-50氨基酸為跨膜的α-螺旋結(jié)構，跨膜區(qū)疏水氨基酸比例為69.6％;調(diào)控元件分析結(jié)果表明，基因組編碼4個宿主啟動子、3個噬菌體本身啟動子和3個不依賴于ρ-因子的終止子。聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜分析證實，ORF38和ORF42分別編碼衣殼蛋白和注射尾針蛋白，與生物信息學分析結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，PPA-ABTNL屬于phiKMV屬，且不含有連接酶、轉(zhuǎn)座酶及毒素蛋白編碼基因，是裂解性噬菌體，可用于噬菌

9、體治療研究。
　　4.連續(xù)3d采用滴鼻方式施用噬菌體粗制液20μL(1012 PFU/mL·d)，7d后取BALB/c小鼠肺臟、肝臟HE染色，與生理鹽水組相比較，噬菌體組小鼠肺臟、肝臟出現(xiàn)輕微炎癥反應，但無異常行為表現(xiàn)。在動物實驗初步證明噬菌體粗制液的安全性以及超聲噴霧對噬菌體效價無顯著影響的基礎上，采用超聲噴霧的方式，施用噬菌體治療水貂出血性肺炎實驗，具體方法為:實驗組、對照組水貂鼻腔接種108 PFU的銅綠假單胞菌，2h后在1

10、20 cm×50 cm×40 cm的密閉容器內(nèi)，使用超聲噴霧器施用不同濃度的噬菌體3 min(流量為3ml/min)，在噬菌體施用后，再額外持留3 min。24 h后檢測水貂肺部的銅綠假單胞菌數(shù)量和噬菌體效價，結(jié)果顯示，與對照組(n=8)相比，MOI=1、10、100噬菌體處理組(n=8)銅綠假單胞菌數(shù)量分別降低了5.08％(P＞0.05)、19.42％.(P＜0.05)和26.13％(P＜0.05)，噬菌體效價分別為3.33 PFU/

11、g(P＞0.05)、293.00 PFU/g(P＜0.05)和13593.67 PFU/g(P＜0.05)。在12d的實驗期內(nèi)，與對照組相比，MOI=1、10、100噬菌體處理組存活率分別為20％(P＞0.05)、80％(P＜0.05)和100％(P＜0.05)。綜合以上分析可見，在30 dm3/只水貂的空間內(nèi)，采用超聲噴霧的方式施用MOI=10的噬菌體PPA-ABTNL，可控制水貂的出血性肺炎。
　　綜上所述，本研究針對引起水貂