銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶基因PSD的克隆表達(dá)及活性鑒定的研究.pdf

1、細(xì)菌生物膜是指被自身產(chǎn)生的外部多糖基質(zhì)，纖維蛋白，脂蛋白等包裹著的菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)群體，作為一種普遍存在的自然現(xiàn)象，它在細(xì)菌的黏附，定植和抗吞噬方面發(fā)揮著重要的作用。它賦予細(xì)菌對(duì)各種因素的抵抗力也是許多持續(xù)性和慢性細(xì)菌感染的根源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，80％以上的感染性疾病是由被膜菌引發(fā)的。在醫(yī)學(xué)上，被膜菌類感染也是慢性頑固性細(xì)菌感染的重要原因。由于生物膜內(nèi)的細(xì)菌幾乎對(duì)所有的抗菌藥物都不敏感，表現(xiàn)極強(qiáng)的耐藥性，所以嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。因此，如果能夠

2、尋找到新的破壞細(xì)菌生物膜的措施，無疑對(duì)阻斷細(xì)菌的致病作用以及提高其對(duì)藥物的敏感性進(jìn)而殺滅耐藥菌都有著重要的意義。此外，有效的控制細(xì)菌生物膜，在工業(yè)、航海業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。 噬菌體，作為細(xì)菌的病毒，能夠特異性的感染和裂解細(xì)菌。早在上個(gè)世紀(jì)二十年代，人們首次引入噬菌體來治療細(xì)菌的感染并取得了良好的效果。但隨著抗生素時(shí)代的來臨，這種治療方法的發(fā)展受到了限制。近年來各種耐藥性菌株的大量出現(xiàn)，使人們?cè)僖淮伟涯抗饧?/p>

3、到了噬菌體上。噬菌體療法，顧名思義，就是運(yùn)用噬菌體及其產(chǎn)物來治療和預(yù)防各種細(xì)菌性的感染疾病。盡管噬菌體在90年前就已經(jīng)被成功的分離，但由于抗生素療法的大量推廣，所以噬菌體在臨床上一直沒有得到廣泛的運(yùn)用。直到最近，大量耐藥性菌株的出現(xiàn)，使得人們不得不尋找一種對(duì)付細(xì)菌的新方法，運(yùn)用噬菌體，這種細(xì)菌的病毒來治療細(xì)菌性疾病，再一次引起了人們的極大關(guān)注。從人類發(fā)現(xiàn)噬菌體以來，各種途徑運(yùn)用噬菌體進(jìn)行的醫(yī)療活動(dòng)已經(jīng)在很多的國家中展開，并且一直沒有噬菌

4、體治療引發(fā)相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥的報(bào)道。因此，噬菌體及其相關(guān)產(chǎn)物在臨床治療方面的運(yùn)用具有廣闊的前景。噬菌體要想進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部裂解菌體細(xì)胞，首先必須突破被膜菌表面的糖被，即胞外多糖被(：Exopolysaccharide，EPS)。已有研究表明噬菌體的確能夠產(chǎn)生多糖解聚酶(polysaccharidedepolymerase，PSD)特異性的降解胞外多糖成分，盡管這種“酶學(xué)消毒法”只是消解了生物膜，脫掉了被膜菌表面的保護(hù)層，但這已經(jīng)大大消除了被膜菌

5、黏附、定植、抗吞噬的致病性以及對(duì)抗生素的耐受性，從而極大的方便了臨床上對(duì)于被膜菌感染的治療。 本室在國家自然科學(xué)基金(30070037)的資助下，已經(jīng)完成對(duì)銅綠假單胞菌噬菌體PaP3的全基因組測(cè)序，基因組序列和注釋已經(jīng)登錄GenBankfNC004466)。我們?cè)赑aP3基因組中發(fā)現(xiàn)PaP3p02基因的編碼產(chǎn)物被推定為多糖解聚酶家簇的成員。這種多糖解聚酶基因產(chǎn)物具有降解細(xì)菌胞外多糖的作用，使之有可能成為專門破壞細(xì)菌生物膜的“酶學(xué)

6、消毒劑”。 基于此，本文首先克隆了多糖解聚酶全長基因，并成功構(gòu)建了多糖解聚酶重組質(zhì)粒，隨后經(jīng)表達(dá)、純化獲得多糖解聚酶融合蛋白。最后，通過對(duì)多糖解聚酶的體外抑菌活性的鑒定來探討其作為細(xì)菌生物膜酶學(xué)降解制劑的應(yīng)用前景。其研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶全長基因的擴(kuò)增：通過對(duì)PCR反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化，擴(kuò)增到了多糖解聚酶全長結(jié)構(gòu)基因，為制備多糖解聚酶融合蛋白奠定了基礎(chǔ)。 2

7、.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶全長基因的克?。簩⒍嗵墙饩勖溉L基因插入原核表達(dá)載體pQE-31，成功構(gòu)建了多糖解聚酶重組質(zhì)粒Pqe-PSD。該重組質(zhì)粒經(jīng)位于多糖解聚酶目的片段5'端的BamHI和3'端HindⅢ雙酶切鑒定后，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒的序列和閱讀框均正確。 3.銅綠假單胞軍菌噬菌體PaP3多糖解聚酶全長基因的表達(dá)與純化：將多糖解聚酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109，獲得了表達(dá)穩(wěn)定的多糖解

8、聚酶基因工程菌。在制備融合蛋白包涵體的過程中，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以分泌型表達(dá)為主，80％的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表達(dá)量是包涵體表達(dá)量的4倍以上。故對(duì)融合蛋白上清行非變性的Ni-NTA柱親和層析以及目的蛋白的分子篩層析純化后，能夠獲得單一條帶的目的蛋白，基本無雜蛋白的存在，蛋白純度在95％以上。說明采用非變性親和層析可以實(shí)現(xiàn)多糖解聚酶融合蛋白的一步純化。BCA法測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度為2.278mg/ml。 4.多糖解聚

9、酶融合蛋白的活性測(cè)定：提取銅綠假單胞菌生物膜多糖成分，用挖孔法測(cè)定多糖解聚酶對(duì)生物膜多糖的降解活性。結(jié)果顯示，加入重組噬菌體PaP3多糖解聚酶基因蛋白孔中，形成了直徑約為1.5cm的透明圓環(huán)，而加入PBS(陰性對(duì)照)的孔中，無透明抑菌環(huán)的形成。初步說明多糖解聚酶基因蛋白對(duì)生物膜的胞外多糖具有一定的降解活性。 5.多糖解聚酶融合蛋白體外抑菌活性研究：采用微量倍比稀釋法測(cè)定多糖解聚酶作用前后銅綠假單胞菌PA3對(duì)四種敏感抗生素(慶大霉

10、素、環(huán)丙沙星、加替沙星、頭孢他啶)MIC，MBC的變化，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多糖解聚酶作用后四種抗生素的相應(yīng)的MIC、MBC都出現(xiàn)了不同程度的降低，其中以頭孢他啶降低最為明顯。提示多糖解聚酶與抗生素的協(xié)同作用具有一定的抗菌活性。采用FITC-ConA/PI熒光雙染銅綠假單胞菌PA3生物膜，與通過多糖解聚酶融合蛋白處理的PA3生物膜對(duì)照，結(jié)果顯示多糖解聚酶的處理可降解細(xì)菌生物膜胞外多糖結(jié)構(gòu)，視野中可見染成綠色的多糖組分小而分散，包裹在胞外多糖組

11、分里的細(xì)菌數(shù)量也大大減少。充分說明多糖解聚酶確實(shí)能夠特異性的降解生物膜的胞外多糖組分并兼有一定的殺菌活性。 綜上所述，本研究通過對(duì)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，擴(kuò)增到了多糖解聚酶全長結(jié)構(gòu)基因，為制備多糖解聚酶融合蛋白奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)，通過對(duì)多糖解聚酶的表達(dá)和純化，拿到了具有活性的重組多糖解聚酶融合蛋白。獲得的融合蛋白經(jīng)體外活性檢測(cè)證實(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌生物膜胞外多糖成分具有一定的降解活性，為進(jìn)一步研究其以后在臨床上各種抗感染治療的運(yùn)用奠定