銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因的克隆及在昆蟲細胞中的表達研究.pdf

1、彈性蛋白酶(elastase)是一種以分解不溶性彈性蛋白為特征的廣譜肽鏈內切酶，廣泛存在于哺乳動物及人的各種組織和體液中。彈性蛋白酶不僅能水解彈性蛋白，而且也可以水解其他蛋自質，如明膠、血紅蛋白、自蛋白、血纖維蛋白等。因此廣泛應用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工、日用化工及環(huán)境治理等行業(yè)，具有極大的經濟價值和應用前景。目前國內主要從豬胰臟中提取，由于酶源受到限制，作為治療用生化藥物和其它方面的應用長期供不應求。 本研究以一產彈性蛋白酶的銅綠

2、假單胞菌基因組DNA為模板，經PCR擴增得到1.5kb的彈性蛋白酶基因，測序后與GeneBank中的銅綠假單胞菌序列比對發(fā)現(xiàn)同源性100﹪。然后對PCR產物進行T-A克隆，獲得質粒pMD18-Ela。將彈性蛋白酶基因切下，轉入到載體pET28-a的6×His標簽序列下游的多克隆位點獲得中間載體pET28a-Ela。連同6×His序列一起將彈性蛋白酶基因克隆到桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的pBacPAK8轉移載體，構建了重組載體pBacPAK8-

3、His-Ela。同時，將綠色熒光蛋白基因直接克隆到pBacPAK8構建一對照載體pBacPAK8-GFP。用BamHⅠ/EcoRⅠ和HindⅢ對pBacPAK8-His-Ela進行雙酶切和單酶切驗證，發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶及上游6×His序列正確插入到桿狀病毒多角體啟動子下。 采用脂質體介導法，將兩個轉移載體和親本病毒一起共轉染昆蟲細胞系sf21，72小時后在熒光顯微鏡下觀察到對照實驗組的細胞發(fā)綠色熒光，供試樣品組的細胞也發(fā)生了明顯的

4、NPV感染癥狀和病變?；厥占毎囵B(yǎng)上清，空斑純化獲得了重組病毒BacPAK-Ela及BacPAK-GFP。以擴大培養(yǎng)后的重組病毒BacPAK-Ela感染sf21細胞，96小時后分離培養(yǎng)基和細胞層進行以下試驗：提取感毒細胞DNA作為模板，對彈性蛋白酶基因cDNA進行PCR擴增，能夠得到1.5kb條帶；提取感毒細胞總蛋白進行SDS-PAGE實驗，可以發(fā)現(xiàn)與彈性蛋白酶(33KDa)大小相近的34KDa條帶。以彈性蛋白為底物的平板水解實驗，發(fā)現(xiàn)

5、感毒細胞裂解液能夠水解其專一底物彈性蛋白，證實了外源基因產物具有一定的生物活性。以地衣紅-彈性蛋白為底物，通過和攻毒后不同時間的細胞裂解液進行水解反應測定酶活，得到了表達產物的最大酶活力為21u/ml。 通過對表達產物的酶學特性分析發(fā)現(xiàn)，外源彈性蛋白酶的最適作用pH值為9.5，在7.0-8.5的范圍內穩(wěn)定，最適作用溫度為37℃，溫度高于37℃時，酶活急劇下降，當溫度達到50℃以上，酶幾乎完全失活。彈性蛋白酶耐熱性實驗發(fā)現(xiàn)，在3