利用原核系統(tǒng)表達(dá)富含二硫鍵蛋白質(zhì)的探索與改進(jìn).pdf

1、隨著基因工程的發(fā)展，工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白類制品越來越多，其市場(chǎng)前景也越來越廣闊。利用外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)具有重要價(jià)值的蛋白是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的核心內(nèi)容和研究熱點(diǎn)，大腸桿菌作為當(dāng)今世界上應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，有眾多優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)繁殖快、成本低廉、待選質(zhì)粒和宿主多，可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白，而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的

2、蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的30％。然而有些重組蛋白質(zhì)制品特別是富含二硫鍵的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)常常為無活性的包涵體，具有生物活性蛋白質(zhì)的獲得需采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，但哺乳細(xì)胞表達(dá)體系產(chǎn)率低、成本高、周期長(zhǎng)、培養(yǎng)要求條件高等缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了基因工程制品的推廣應(yīng)用。因此改善大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)使之可以應(yīng)用于富含二硫鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)，是一個(gè)挑戰(zhàn)性的課題。本課題選取具有工業(yè)化前景且富含二硫鍵的曲霉植酸酶作為研究目標(biāo)，探索和改進(jìn)其在大腸桿菌中的

3、表達(dá)，通過基因操作將該基因分別連接4種不同的周質(zhì)定位信號(hào)肽序列及利用兩株具有氧化型胞質(zhì)的大腸桿菌突變株來表達(dá)目的蛋白，以促進(jìn)二硫鍵的形成，結(jié)果使植酸酶在原核表達(dá)中的活性大大提高；我們同時(shí)還對(duì)不同菌株的最佳表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。主要結(jié)果如下：
　　 1．具有氧化型細(xì)胞質(zhì)的工程菌株能夠明顯提高植酸酶的活性。構(gòu)建植酸酶原核表達(dá)載體，利用兩種氧化型突變大腸桿菌菌株作為宿主表達(dá)植酸酶，由于氧化型突變菌株的胞質(zhì)環(huán)境及氧化狀態(tài)的硫氧還蛋白家族類

4、蛋白質(zhì)有利于二硫鍵的形成，使植酸酶活性有明顯提高，突變株Rosetta-gami（DE3）與一般普通表達(dá)菌株比，在一般誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下植酸酶活性提高234％，另一株突變菌株TransB（DE3），其植酸酶活性也提高了220％。
　　 2．植酸酶周質(zhì)定位有助于植酸酶活性的提高。實(shí)驗(yàn)中選取含有周質(zhì)定位作用信號(hào)肽的質(zhì)粒pET27b（含有信號(hào)肽序列SSPelB）作為表達(dá)載體，信號(hào)肽與目的蛋白的融合可以促進(jìn)目的蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸桿菌的周

5、質(zhì)中，而周質(zhì)不但具有與胞質(zhì)不同的氧化環(huán)境而且包含促進(jìn)二硫鍵形成的Dsb酶系統(tǒng)。為了篩選運(yùn)轉(zhuǎn)效率更高的信號(hào)肽，克隆得到了另外三種周質(zhì)蛋白的信號(hào)肽序列即DsbA、DsbC及堿性磷酸酶的信號(hào)肽序列，分別命名為SSDsbA、SSDsbC和SSPhoA，用上述三種信號(hào)肽分別替代pET27b中原有的信號(hào)肽序列SSPelB，構(gòu)建了三個(gè)新的表達(dá)載體。將植酸酶基因phyA分別插入這四個(gè)周質(zhì)定位表達(dá)載體中，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得了四株工程菌（SSPelB-P

6、hyA、SSDsbA-PhyA、SSDsbC-PhyA、SSPhoA-PhyA）。與一般普通表達(dá)菌株比，四株具有周質(zhì)定位的工程菌所產(chǎn)植酸酶活性均有大幅提高，活性分別提高164％、246％、225％、186％。
　　 3．最佳發(fā)酵條件的篩選。設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)劑濃度等條件，研究不同的發(fā)酵條件及組合對(duì)植酸酶表達(dá)量及酶活性的影響，通過30個(gè)不同的條件組合進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。發(fā)酵結(jié)果顯示，誘導(dǎo)劑濃度的改變對(duì)酶活性的影響比溫度改變影響明顯

7、，0.25mM IPTG是大多數(shù)菌株的最佳誘導(dǎo)劑濃度；溫度對(duì)植酸酶的表達(dá)及活性的影響較為復(fù)雜，不同工程菌株的最佳誘導(dǎo)溫度介于25℃～37℃溫度范圍。
　　 4．發(fā)酵條件優(yōu)化利于植酸酶活性的提高。經(jīng)過各個(gè)菌株最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化，利用信號(hào)肽將植酸酶周質(zhì)定位的菌株中SSDsbA-PhyA活性提高最為明顯，在其最佳發(fā)酵條件28℃/0.25mM IPTG下相對(duì)于使植酸酶定位于還原型胞質(zhì)可以使植酸酶催化活性提高525％；氧化型細(xì)胞質(zhì)的菌株中