蛋白質(zhì)表達、純化與晶體結構.pdf

1、第1章非出血活性的五步蛇毒鋅金屬蛋白酶FII與其內(nèi)源性三肽抑制劑復合物的晶體結構研究 P-I類蛇毒金屬蛋白酶可以直接水解纖維蛋白/纖維蛋白原，因而可作為潛在的溶栓藥。但是這類酶同時還可水解血管基底膜蛋白，因此可能導致出血副反應。為了更好地了解來源于五步蛇蛇毒的鋅金屬蛋白酶FII的作用機制，為對其進行結構修飾以提高其藥理作用的特異性并減少副反應提供結構方面的信息，我們采用汽相擴散懸滴法制備FII蛋白晶體，并對該晶體進行X-射線衍射

2、分析，得到了FII蛋白的1.9 A分辨率的晶體結構，發(fā)現(xiàn)一個該酶分子由兩個亞結構域組成，并含兩個高度保守的特征性序列：鋅結合序列H<,142>E<,143>XXH<,146>XXGXXH<,152>和Met—turn：C<,163>Ⅰ<,164>M<,165>。其中N-端結構域占了蛋白全長的大約3/4，是一個典型的a/β結構。4個a螺旋圍繞著四個平行的和一個反平行的β片層。C-端結構域包含了一個長的a螺旋和Met-turn。蛋白水解活性

3、必需的鋅離子位于兩個結構域之間的間隙中，并與高度保守序列H<,142>E<,143>XXH<,146>XXGXXH<,152在>中三個組氨酸殘基的Nε2氮原子和一個水分子螯合。在電子密度圖上還清晰地看到在活性中心周圍有一個三肽，其序列為Lys—Asn—Leu(KNL)，通過一些實驗證實這一三肽對FII的活性有抑制作用。 我們實驗室在畢赤酵母中成功地表達了來源于Agkistrodon acutus的無出血活性的P-

4、I類重組蛇毒金屬蛋白酶rFII，并發(fā)現(xiàn)它對大鼠頸動脈血栓動物模型有良好的溶栓作用。但在高劑量時，rFII還可以降解血管基底膜蛋白，因此存在潛在的出血副反應。我們曾經(jīng)嘗試使用畢赤酵母表達的rFII進行結晶，希望通過晶體結構來解釋其作用機理，并利用結構信息來對其進行改造，增加對作用底物的選擇性，以減少臨床應用的副反應。然而，始終未能得到晶體。推測其原因可能是酵母表達的異源蛋白存在不均一的翻譯后修飾所致。大腸桿菌Escherichia col

5、i(E.coli)是目前常用的另一個表達異源蛋白的宿主，具有不對所表達的蛋白進行翻譯后修飾的優(yōu)點，迄今為止大部分成功得到晶體結構的重組蛋白都是E.coli表達。因此我們重新將多個片斷長度的rFII基因克隆到大腸桿菌表達載體pETl5b、pET32a及pMAL c2x和pMAL p2x上，在大腸桿菌菌株BL2l(codonplus)和／或Origami B中過表達。并采用親和層析、離子交換層析和分子篩層析純化“可溶性蛋白”，或采用尿素或鹽

6、酸胍從包涵體中變性并純化重組蛋白，采用稀釋、親和柱輔助的手段使變性蛋白復性。未能得到可溶性有活性的rFII蛋白。 第3章 芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子2(ARNT2)在大腸桿菌的克隆、表達和純化bHLH/PAS蛋白超家族(basic Helix-Loop-Helix Per-Arnt-Sim proteins)是在許多重要生理和發(fā)育過程基因表達網(wǎng)絡中關鍵的調(diào)節(jié)因子。ARNT2被認為是bHLH/PAS蛋白家族成員中的通用型配基，主要在中樞

7、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟表達，可與HIF-Iα結合形成二聚體，發(fā)揮調(diào)控缺氧應答的功能。ARNT2和SIM蛋白形成的二聚體可以調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌軸的發(fā)育進程。為了了解ARNT2在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的分子機制，我們在E.coli克隆、表達和純化了大鼠ARNT2(330-711)，但是未能得到晶體。 第4章 PDE9A(催化結構域)在大腸桿菌的表達、純化及初步的晶體學研究環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)可以通過

8、降解環(huán)核苷酸(cAMP，caMP)而控制其在細胞內(nèi)的濃度，從而影響多種生理過程。深入了解PDEs對環(huán)核苷酸底物特異性和抑制劑選擇性的結構基礎可以幫助設計效應更強、副作用更少的PDE抑制劑。我們從大腸桿菌菌株BL21(codonplus)表達并純化了野生型和突變性PDE9A(催化結構域)，并得到了未結合配基的PDE9A、PDE9A和其水解產(chǎn)物GMP、PDE9A和非選擇性抑制劑theophyline復合物以及兩個PDE9A突變體和底物cGM