蛋白質(zhì)純化膠體過濾法

1、不同大小的蛋白質(zhì)分子進入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊，GelFiltration）。儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn1.6100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollect需準備干凈試管約100支）；濃縮用離心機（低速5000rpm）；濃縮用離心管Centriprep30（Amicon4322）請注意其使用方法藥品試

2、劑：膠體SephacrylS300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA150平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。BufferA150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合（BioRad151

3、1901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1350）方法步驟：管柱裝填：1）以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；并請了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA150試看

4、管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng)，不要裝置于交通要沖。2）依預(yù)估量取出Sephacryl膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。3）在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上方的液面逐漸降低時，可于頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90cm.4）膠體

5、完全沈降后，小心以bufferA150加滿管柱，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5mLtube.5）膠柱流洗約100mL后，關(guān)閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高，注意勿破壞膠體表面平整；然后打開出口，使液面下降至膠體面，再關(guān)閉出口，準備注入樣本。樣本色析進行：6）以微量移液器或滴管吸取樣本（樣本體積不得超過膠體總體積的3%

6、），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面！（樣本確實體積_______mL）實驗材料SephacrylS300膠體試劑、試劑盒緩沖液bufferA150儀器、耗材色析管柱鐵夾試管鐵架水平儀收集器濃縮用離心機濃縮用離心管實驗步驟一、儀器設(shè)備色析管柱（PharmaciaCcolumn1.6100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollect需準備干凈試管約100支）；濃縮用離心機（低速5000rpm）

7、；濃縮用離心管Centriprep30（Amicon4322）請注意其使用方法。二、藥品試劑膠體SephacrylS300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA150平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。Buf

8、ferA150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合（BioRad1511901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1350）三、管柱裝填1.以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；并請了解管柱的

9、構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA150試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng)，不要裝置于交通要沖。2.依預(yù)估量取出Sephacryl膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。3.在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上

10、方的液面逐漸降低時，可于頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90cm。4.膠體完全沈降后，小心以bufferA150加滿管柱，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5mLtube。5.膠柱流洗約100mL后，關(guān)閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高，注意勿破壞膠體表面平整；然后打開出口，使液面下降至膠體面，再關(guān)閉出口，準備注入樣本