植酸酶PHYA的高效表達(dá)及二硫鍵的功能分析.pdf

1、在飼料中添加植酸酶可提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動物對礦質(zhì)元素的吸收率,并減輕動物排泄物中磷對環(huán)境的污染。植酸酶的飼喂效果已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)得到了確證,但目前還未能得到很好的推廣應(yīng)用。其主要原因是植酸酶在天然材料中含量太低：另一方面,酶的穩(wěn)定性不能完全滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此,提高植酸酶基因的表達(dá)水平,改善植酸酶的穩(wěn)定性是一個亟待解決的問題。 以往研究者往往通過體外添加酶的保護劑、酶的固定化等手段提高植酸酶的穩(wěn)定性,這些措

2、施都取得了一定的效果,但不是十分的理想。隨著基因工程的發(fā)展,在分子水平上對酶基因進(jìn)行改造為改良酶蛋白的性質(zhì)開辟了一條新的途徑。二硫鍵對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及功能具有重要的作用,植酸酶分子中含有5對二硫鍵,目前關(guān)于二硫鍵對植酸酶的催化活性和構(gòu)象穩(wěn)定性的研究較少,僅限于二硫鍵整體上在植酸酶的去折疊過程中對維持酶的空間結(jié)構(gòu)和催化活性的影響。 本研究以自行篩選的產(chǎn)胞外植酸酶的黑曲霉Aspergillus niger N-J為出發(fā)菌株,克隆

3、了植酸酶phyA基因,將其在畢赤酵母(Pichia pastoris)中實現(xiàn)了高效表達(dá),酶學(xué)性質(zhì)研究表明表達(dá)的植酸酶具有良好的應(yīng)用特性。在此基礎(chǔ)上,首次對植酸酶(PHYA)5對二硫鍵分別進(jìn)行了缺失研究,系統(tǒng)地比較了缺失突變體與野生型植酸酶在結(jié)構(gòu)和功能上的區(qū)別。本實驗的主要結(jié)果如下： 1.以自行篩選的產(chǎn)胞外植酸酶的黑曲霉Aspergillus niger, N-J基因組DNA為模板,PCR擴增得到植酸酶phyA基因片段。序列分析表

4、明phyA開放閱讀框長度為1347bp,包含編碼448個氨基酸的植酸酶成熟肽的完整序列；在其編碼的氨基酸序列中,存在組氨酸酸性磷酸酶的活性位點保守序列、11個潛在的N-糖基化位點及10個半胱氨酸殘基。將phyA基因構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPICZaA/phyA,轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichia pastoris GS115,得到了高表達(dá)工程菌株。誘導(dǎo)后發(fā)酵液植酸酶比活力較出發(fā)菌株相比提高了30,000倍,酶學(xué)性質(zhì)研究表明表達(dá)的植酸酶具有優(yōu)良的工業(yè)應(yīng)

5、用特性,從而實現(xiàn)了植酸酶的高效表達(dá)。 2.利用定點突變技術(shù)將植酸酶分子中的5對二硫鍵分別進(jìn)行了突變,構(gòu)建了5個二硫鍵分別缺失的植酸酶突變體(C12S, C263S, C395S, C417S和C446S)的表達(dá)質(zhì)粒。5個突變體均在畢赤酵母中得到了高效表達(dá)。 3.對純化后酶蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究表明,5個缺失突變體在酸性pH范圍內(nèi)均具有較高的酶活性,比較適合在動物酸性胃腸環(huán)境中發(fā)揮作用,但二硫鍵Cys12-Cys21和Cys2

6、45-Cys263的缺失造成了酶蛋白pH適用范圍的縮??；同時Cys12-Cys21的缺失降低了酶蛋白的最適作用溫度。酶促反應(yīng)動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),二硫鍵Cys52-Cys395、Cys196-Cys446、Cys245-Cys263和Cys417-Cys425的缺失增大了酶對底物的親和力及催化效率；而Cys12-Cys21的缺失降低了酶與底物的結(jié)合能力,同時也降低了酶的催化效率。 4.對野生型及突變體植酸酶的空間構(gòu)象分析表明,5對二硫

7、鍵的缺失均對酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了或多或少的影響,其中Cys245-Cys263和Cys417-Cys425缺失突變體的分子結(jié)構(gòu)變得尤為松散。 5.對酶抵抗變性劑穩(wěn)定性的分析發(fā)現(xiàn),二硫鍵缺失突變體抗變性劑的能力較野生型均降低,但不同缺失突變體的表現(xiàn)各異。其中二硫鍵Cys12-Cys21、Cys245-Cys263和Cys417-Cys425的缺失極大地降低了酶在鹽酸胍溶液中的穩(wěn)定性,而Cys52-Cys395和Cys196-Cy