引入二硫鍵提高黑曲霉XynⅢ熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、木聚糖酶在造紙、飼料、食品以及能源等領(lǐng)域的應(yīng)用價值已經(jīng)得到了肯定,但由于紙漿處理通常是在高溫條件下進(jìn)行,在飼料制粒加工中也需要短暫的高溫處理,很多天然的木聚糖酶熱穩(wěn)定性較差,成為它們在飼料、造紙行業(yè)中應(yīng)用的瓶頸。因此,對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的改良十分必要。
　　 本實驗室篩選的黑曲霉A-25是一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株,由它分泌的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶屬于G/11家族,最適反應(yīng)溫度為48℃,不適于在高溫的生物工程環(huán)境下使用。本研究將黑曲

2、霉A-25所分泌的XynⅢ基因序列(登錄號為EU375728)與另外兩種已經(jīng)引入二硫鍵的的木聚糖酶序列(登錄號分別為P55329和P36217)進(jìn)行序列比對,并設(shè)計7對突變引物,分別將原蛋白序列的第30位、47位、128位、130位、174位、177位、178位的氨基酸替換為半胱氨酸,即(G30C；D47C；V128C；S130C；N174C；N177C；F178C)。
　　 通過組合,用重疊延伸PCR和常規(guī)PCR對野生酶基因進(jìn)

3、行定點雙突變,獲得四對突變基因即四對二硫鍵(G30C:D47C,S130C:N174C,S130C:N177C,V128C:F178C)。突變基因經(jīng)過酶切、酶連、轉(zhuǎn)化和電泳鑒定,突變基因確實克隆到表達(dá)載體pET20b上。將含有突變基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),獲得具有木聚糖酶活性的蛋白。
　　 通過對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):野生酶在50℃保溫30min后殘余酶活為18％左右,突變體酶S130C/N174C和V12

4、8C/F178C分別為70％和80％,其熱穩(wěn)定性較野生酶的提高了四倍左右；而S130C/N177C和G30C/D47C的熱穩(wěn)定性與野生酶相比有所降低,48℃保溫30min后G30C/D47C的殘余酶活僅為20％,50℃保溫30min后幾乎為零；S130C/N177C在48℃保溫30min后酶就完全失活；S130C/N174C和V128C/F178C在50℃條件下的半失活時間有原來的12min分別提高到31min和25min?？傮w說來本研