蛋白激酶A和鈣蛋白酶參與調(diào)控血小板Sema4D切割的機制研究.pdf

1、神經(jīng)導(dǎo)向因子Semaphorin4D(Sema4D; CD100)已經(jīng)證明在血小板上表達(dá)，并且通過接觸依賴性方式加強膠原誘導(dǎo)的糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)/FcRγ復(fù)合體信號通路中脾酪氨酸激酶(Syk)的活化來促進(jìn)血栓形成。我們之前的研究已經(jīng)證明血小板Sema4D胞外段可以被金屬蛋白酶ADAM17切割，產(chǎn)生一個120 kDa的具有生物學(xué)活性的大片段。并且，我們也鑒定到Sema4D胞內(nèi)段部分序列與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)血小板Sema4D的胞外切割。但我

2、們的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，還有其他的調(diào)控機制存在。
　　首先，我們探索了蛋白激酶A（PKA）是否參與Sema4D胞外切割的調(diào)控。PKA是環(huán)腺苷酸（cAMP）依賴的蛋白激酶，PKA在血小板內(nèi)起著負(fù)反饋作用，PKA的活化能夠抑制刺激劑誘導(dǎo)的血小板活化，維持血小板在靜息狀態(tài)從而自由循環(huán)。抑制PKA的活性能夠誘導(dǎo)金屬蛋白酶介導(dǎo)的血小板GPIbα的切割。為了研究PKA是否也參與Sema4D胞外段切割，我們使用PKA抑制劑H89和PKA活化劑for

3、skolin來進(jìn)行一系列實驗，結(jié)果表明抑制PKA能夠誘導(dǎo)金屬蛋白酶介導(dǎo)的Sema4D胞外切割，活化PKA能夠抑制刺激劑誘導(dǎo)的Sema4D胞外切割。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制PKA導(dǎo)致的Sema4D胞外段切割是通過提高ADAM17酶活性引起的，而不是通過使鈣調(diào)蛋白從Sema4D解離造成的。
　　同時，我們注意到Sema4D也發(fā)生胞內(nèi)段的切割，主要表現(xiàn)為在某些情況下，血小板Sema4D發(fā)生胞外切割后殘余的28 kDa胞內(nèi)小片段會消失。但是，S

4、ema4D的胞內(nèi)水解切割的詳細(xì)機制還不清楚。之前的研究已經(jīng)證明鈣調(diào)蛋白能夠和Sema4D胞內(nèi)段結(jié)合，并且與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的分子往往都是鈣蛋白酶(calpain)的底物。這給我們帶來新的啟示:Sema4D胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可能被胞內(nèi)鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白酶calpain切割。因此，我們對calpain調(diào)節(jié)Sema4D切割的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:1）血小板Sema4D胞內(nèi)切割主要是由非生理性刺激劑包括W7、A23187和dibucaine所介導(dǎo)