絲裂原活化蛋白激酶、鈣蛋白酶和膜聯(lián)蛋白A5在醛固酮誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制及相關(guān)臨床研究.pdf

1、目的：
　　1.研究絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、鈣蛋白酶（calpain）和膜聯(lián)蛋白A5（ANXA5）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在醛固酮（ALD）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，了解calpain、ANXA5、MAPKs之間的調(diào)控關(guān)系，闡明ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用機(jī)制。2.觀察氧化苦參堿（OMT）減輕ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷這一保護(hù)作用中MAPKs、calpain和ANXA5表達(dá)的變化，進(jìn)一步闡釋ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，尋找

2、防治心肌細(xì)胞凋亡的有效作用靶點(diǎn)。3.闡明ANXA5基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓左心室肥厚易感性的關(guān)系，為左心室肥厚的分子機(jī)制提供新的線索。
　　方法：
　　1.采用0.06%胰酶消化、差速貼壁法分離純化1-3d SD新生大鼠心肌細(xì)胞做原代培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定心肌細(xì)胞及其純度。MTT探索ALD損傷心肌細(xì)胞的最佳作用濃度及作用時(shí)間。建立ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型，并用MTT法和

3、流式細(xì)胞儀驗(yàn)證?；蛐酒瑱z查MAPKs、calpain、ANXA5基因表達(dá)，Real-time PCR、Western-blotting法檢測(cè)calpain1、calpain2、p38、JNK、ERK、ANXA5、p-caspase3的mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、ALD組、ALD+anti-calpain1組、ALD+anti-calpain2組、ALD+anti-P38組、ALD+anti-ERK組、ALD+anti-JNK

4、組。對(duì)各組細(xì)胞采用Real-time PCR和Western-blotting法檢測(cè)calpain1、calpain2、p38、JNK、ERK mRNA和蛋白表達(dá)水平?？笰NXA5干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌后，Western-blotting法檢測(cè)calpain1、calpain2、p38表達(dá)。2.原代心肌細(xì)胞用氧化苦參堿（OMT）干預(yù)，分為對(duì)照組、ALD組、ALD+L-OMT組（L低劑量，OMT濃度25μg/ml）、ALD+H-OMT組（H

5、高劑量，OMT濃度50μg/ml）、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組。各組細(xì)胞采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，LDH檢測(cè)細(xì)胞毒性，Giemsa染色和HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，Real-time PCR和Western-blotting法檢測(cè)calpain1、calpain2和p38、ANXA5mRNA和蛋白表達(dá)水平。3.研究對(duì)象為貴州省貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院原發(fā)性高血壓患者，共850例。其中包括337例原發(fā)性高血壓伴左心室肥厚患者,513例原發(fā)

6、性高血壓非左心室肥厚患者。所有入選者均進(jìn)行心臟超聲的檢測(cè)并采集外周靜脈血。SNaPshot法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象外周靜脈血中ANXA5基因多態(tài)性，觀察高血壓人群外周靜脈血中ANXA5基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓并發(fā)左室肥厚發(fā)病率之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.胰酶消化法成功分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞并經(jīng)肌鈣蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示心肌細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)95%以上。用MTT檢測(cè)確定ALD最佳濃度為10-5mol/L，最佳作用時(shí)間為48小時(shí)，此條件下

7、ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率達(dá)37.8%。10-5mol/L濃度下ALD作用48h后心肌細(xì)胞的基因表達(dá)結(jié)果：較對(duì)照組比較ANXA5增高9.63倍，p38增高4.05倍，calpain1、calpain2增高3.31倍和2.16倍，JNK、ERK1/2增高1.43和1.62倍。10-5mol/L濃度下ALD作用48h后心肌細(xì)胞中calpain1、calpain2、p38、p-p38、ANXA5、p-caspase3蛋白表達(dá)增加，mRNA表達(dá)增

8、加（p<0.05），JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加不明顯，mRNA表達(dá)增高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。anti-calpain1干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，calpain1、calpain2和p38 mRNA水平顯著降低（p<0.05），表明calpain1的蛋白及mRNA表達(dá)對(duì)calpain2、p38蛋白及mRNA表達(dá)有影響，對(duì)ERK1/2、JNK蛋白及mRNA表達(dá)沒(méi)有影響；anti-calpa

9、in2干預(yù)后，calpain2和p38 mRNA水平顯著降低（p<0.05），表明calpain2的蛋白及mRNA表達(dá)對(duì)p38蛋白及mRNA表達(dá)有影響，對(duì)calpain1、ERK1/2、JNK蛋白及mRNA表達(dá)沒(méi)有影響；anti-p38、anti-JNK，anti-ERK干預(yù)后，分別有p38、JNK、ERK1/2 mRNA水平顯著降低（p<0.05），表明p38、JNK、ERK1/2的蛋白及mRNA表達(dá)對(duì)calpain1、calpain

10、2蛋白及mRNA表達(dá)沒(méi)有影響，這三者之間也沒(méi)有相互影響。anti-calpain1，anti-calpain2，anti-JNK，anti-ERK，anti-p38干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，ant-calpain1、ant-calpain2、ant-p38組心肌細(xì)凋亡率較ALD組顯著降低（p<0.05），但仍高于對(duì)照組（p<0.05），表明與ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的是calpain1、calpain2和p38。ANXA5抑制劑干

11、預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，較ALD組比較calpain1、calpain2蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變，p38蛋白表達(dá)量降低，p38mRNA表達(dá)明顯減低（p<0.001），表明ANXA5蛋白及mRNA表達(dá)對(duì)p38的蛋白和mRNA表達(dá)有影響，對(duì)calpain1、calpain2的蛋白及mRNA表達(dá)沒(méi)有影響。2.MTT實(shí)驗(yàn)表明ALD組細(xì)胞存活率值顯著低于對(duì)照組（p<0.05）；ALD+L-OMT組（25μg/ml）和ALD+H-OMT組（5

12、0μg/ml）ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組細(xì)胞存活率顯著高于ALD組（p<0.05）。LDH外漏實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ALD組LDH外漏率顯著高于對(duì)照組（p<0.05）；ALD+L-OMT組和ALD+H-OMT組、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組LDH外漏率值均顯著低于ALD組（p<0.05）。心肌細(xì)胞經(jīng)Giemsa染色后，細(xì)胞核被染為藍(lán)紫紅色，細(xì)胞漿染成淡紅色。正常組的細(xì)胞核稍偏、大小適宜呈正常結(jié)構(gòu)；ALD組的細(xì)胞肥大、胞核居中；

13、與ALD組比較，ALD+L-OMT組、ALD+H-OMT組、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組細(xì)胞表面積減小，形態(tài)接近于正常。Western-blotting及Real-time PCR結(jié)果顯示與ALD組比較，ALD+L-OMT組和ALD+H-OMT組、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組與ALD組calpain1，calpain2和p38、ANXA5蛋白表達(dá)減低，mRNA表達(dá)減低（p<0.05）。3.左室肥厚患者中ANXA5SNPs

14、表達(dá)是一項(xiàng)重要的危險(xiǎn)因素，ANXA5SNPrs1050606與高血壓左心室肥厚患病易感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（顯性患者：p=0.008；共顯性患者p=0.006）。此外，也研究也證明在原發(fā)性高血壓左室左室肥厚患者中，ANXA5的M1，M2單體也被證明是危險(xiǎn)因素（p=0.022和0.032）。
　　結(jié)論：
　　1.ALD可以通過(guò)上調(diào)calpain1、calpain2、ANXA5和p38表達(dá)水平，激活caspase3來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

15、calpain、ANXA5與MAPKs之間存在調(diào)控關(guān)系，機(jī)制可能為calpain1、2通過(guò)調(diào)控ANXA5來(lái)影響p38表達(dá)，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞凋亡。2. OMT可以通過(guò)下調(diào)calpain1、 calpain2、ANXA5和p38的表達(dá)水平來(lái)減輕心肌細(xì)胞凋亡。calpain1、 calpain2、ANXA5和p38可以作為減輕ALD誘導(dǎo)的心肌凋亡、改善高血壓心肌重構(gòu)、延緩心衰進(jìn)程的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。3.ANXA5rs1050606,M1和M2單倍