p38絲裂原活化蛋白激酶在小鼠圍植入期子宮內(nèi)膜及胚胎中的表達(dá)及作用.pdf

1、目的： 胚胎植入是指在特定的植入窗口期，胚泡附著并侵入子宮內(nèi)膜的全過(guò)程。在這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中，激素、細(xì)胞因子、黏附分子、蛋白、肽及酶類等介導(dǎo)了一系列分子生物學(xué)事件，在這些因素的精細(xì)調(diào)控下，某些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，調(diào)控特定基因的表達(dá)，使胚泡滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜發(fā)生同步協(xié)調(diào)變化，從而使得發(fā)育正常且具有侵入性的胚泡順利植入。 近年來(lái)，盡管關(guān)于胚胎植入機(jī)理的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題亟待深入探討。如在植入過(guò)程中哪些信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活?激活這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)分子來(lái)自母體還是來(lái)自胚胎、或是兩者共同作用?各通路間的關(guān)系如何?等等。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)通路是真核細(xì)胞調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡及細(xì)胞間功能同步化的基本信號(hào)通路。目前，至少鑒定出了4種MAPK超家族成員，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulated kinases，ERK

3、)、p38MAPK、C-jun氨基末端/應(yīng)激活化蛋白激酶(thec-Jun N-terminal kinase or stress-activated protein kinases，JNK/SAPK)和大絲裂原活化蛋白激酶1(big MAP kinase 1，BMK 1/ERK5)通路。這些蛋白及酶構(gòu)成相互交織的信號(hào)級(jí)聯(lián)通路，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞中起重要作用。 近幾年國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路在早期胚胎發(fā)育、子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚泡黏

4、附、滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖以及侵入子宮內(nèi)膜過(guò)程中都起著重要作用。其中p38MAPK信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞間功能同步等多種生理過(guò)程，并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的中樞。最近又有實(shí)驗(yàn)顯示，p38MAPK在小鼠植入前胚胎中激活，且其激活是子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程中所必需的，但國(guó)內(nèi)尚未見這方面的報(bào)道。關(guān)于圍植入期子宮內(nèi)膜中p38MAPK的表達(dá)狀況及在體注射p38MAPK特異性抑制劑干擾植入的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

5、 本實(shí)驗(yàn)以妊娠昆明小鼠為動(dòng)物模型，傭免疫組化法檢測(cè)圍植入期胚胎和子宮內(nèi)膜中p38MAPK的表達(dá)及其變化規(guī)律；用動(dòng)物在體宮腔內(nèi)注射p38MAPK特異性抑制劑和體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)，觀察p38MAPK對(duì)早胚發(fā)育及植入的影響，從而探討p38MAPK與胚胎植入的相關(guān)關(guān)系，以進(jìn)一步揭示植入的機(jī)制，為提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)等輔助生殖技術(shù)的成功率以及研究和開發(fā)新型抗植入避孕藥物提供理論依據(jù)和動(dòng)物模型。 研究方法： 1.取真

6、孕及假孕1～8天小鼠子宮，石蠟包埋切片，用免疫組化及圖象分析法檢測(cè)圍植入期子宮內(nèi)膜中p38MAPK的表達(dá)及變化規(guī)律，同時(shí)取未孕動(dòng)情期子宮作為對(duì)照組。 2.取未經(jīng)產(chǎn)雌性小鼠常規(guī)促排卵，收集2細(xì)胞，4細(xì)胞，8細(xì)胞，桑葚胚，胚泡等不同發(fā)育階段的早胚，用免疫組化及免疫熒光法測(cè)定早胚中p38MAPK的表達(dá)及變化情況。 3.p38MAPK抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：取正常妊娠第4天小鼠，剖腹在兩側(cè)子宮角處分別注射等劑量的p38MAPK特

7、異性抑制劑和生理鹽水，于妊娠第8天頸椎脫臼處死小鼠，檢查植入胚胎數(shù)。同時(shí)取子宮作切片，觀察胚胎及子宮內(nèi)膜的組織學(xué)變化。 體外實(shí)驗(yàn)：取經(jīng)過(guò)PMSG、HCG超排卵后孕2天小鼠，分離輸卵管，獲取2細(xì)胞期胚卵，體外培養(yǎng)。將胚卵隨機(jī)分為5組，接種到添加不同成分的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。組Ⅰ僅含基礎(chǔ)培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)；組Ⅱ含基礎(chǔ)培養(yǎng)液和DMSO(溶劑對(duì)照)；組Ⅲ、組Ⅳ、組Ⅴ的基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)含不同濃度的p38MAPK特異性抑制劑SB2O3580，其劑量分

8、別為：0.21Jm0l/L； 2pmol/L； 20pmol/L。將培養(yǎng)板置37℃、5％CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每12小時(shí)觀察一次，看其發(fā)育情況。48小時(shí)后觀察其發(fā)育到胚泡的情況，用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)胚胎細(xì)胞存活率，用免疫熒光法檢測(cè)各組胚泡中p38MAPK的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.在小鼠子宮內(nèi)膜中，p38MAPK主要表達(dá)于腔上皮、腺上皮和蛻膜細(xì)胞的胞漿內(nèi)，偶爾在胞核中。真孕組孕3d，腔上皮中p38MAPK呈陽(yáng)性表達(dá)，

9、孕4～5天呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，此后p38MAPK在腔上皮的表達(dá)逐漸減弱；腺上皮中p38MAPK的表達(dá)從孕4天開始一直維持在陽(yáng)性水平，從孕5d開始蛻膜細(xì)胞中p38MAPK的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。假孕組只有孕4天呈弱陽(yáng)性表達(dá)。 2.p38MAPK在小鼠胚植入前各細(xì)胞期均呈陽(yáng)性表達(dá)，隨著妊娠進(jìn)展，其表達(dá)逐漸加強(qiáng)。 3.p38MAPK抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，抑制劑組(10μM)平均胚胎植入數(shù)為2.6250±0.5175，明顯低于空白對(duì)照(

10、7.1250±0.8345)和生理鹽水組(6.2500±0.8864)，與兩者相比，差異十分顯著(P<0.01)。組織學(xué)觀察結(jié)果：抑制劑組胚胎組織呈退化壞死狀態(tài)，胚胎周圍蛻膜細(xì)胞呈明顯的空泡樣變性，蛻膜及胚胎中均可見大量血細(xì)胞浸潤(rùn)。 體外實(shí)驗(yàn)顯示，抑制劑組與對(duì)照組胚卵以同樣的速率發(fā)育到8細(xì)胞階段，但是抑制劑組的胚卵發(fā)育卻停滯在8-16細(xì)胞之間，不能發(fā)育到胚泡階段，比對(duì)照組發(fā)育晚1-2個(gè)細(xì)胞期。但抑制劑組胚卵仍具存活能力，將其移入