OPN和integrinβ3在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其抗體對著床的影響.pdf

1、研究背景和目的： 胚泡著床是指胚泡粘附并植入子宮內(nèi)膜的一個連續(xù)復(fù)雜的生理過程，是胚泡與母體子宮內(nèi)膜相互作用的過程。胚泡著床過程受到多種因素的調(diào)節(jié)，不僅受母體因素和胚泡本身因素的調(diào)控，而且還有許多生物大分子物質(zhì)參與，如骨橋蛋白( osteopontin，OPN)和整合素αvp3等。骨橋蛋白是一種含精氨酸-甘氨酸一天冬氨酸(Arg- Gly- Asp，RGD)的分泌型糖基化磷蛋白，歸類于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。OPN最先是從骨組織分離的，后

2、來發(fā)現(xiàn)在分泌期子宮內(nèi)膜、入侵內(nèi)膜的細(xì)胞滋養(yǎng)層、內(nèi)膜腺上皮、蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞及胎盤表面上也有表達(dá)。OPN既是細(xì)胞因子，又是細(xì)胞粘附分子。雖然OPN能與各種整合素受體結(jié)合，但是整合素αvβ3是OPN的最主要的受體。OPN的主要生物學(xué)功能是通過其特異性序列RGD與整合素等多種受體結(jié)合，對細(xì)胞的粘附和遷移起重要作用。OPN和整合素αvβ3在胚泡著床中起重要作用。研究OPN和整合素αvβ3對胚泡著床的影響，闡明其作用的分子機制是非常重要的。本研究

3、將從以下幾方面進(jìn)行研究：(1)建立成功的小鼠早期妊娠模型；(2)檢測骨橋蛋白和整合素p3在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，明確OPN和整合素β3表達(dá)規(guī)律；(3)研究骨橋蛋白抗體和整合素β3抗體對小鼠胚泡著床的影響。 方法： 1.小鼠早期妊娠模型的建立 選擇動情前期的雌性昆明小鼠20只，隨機分為二組，每組10只，促排卵組腹腔注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serumgonadotropin，PMS

4、G)和HCG促排卵治療，對照組注射生理鹽水，隨后雌雄交配，次日檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓計為妊娠第1天(孕Dl)。于妊娠第8天，用頸椎脫臼法處死，迅速剖腹，檢查子宮，記錄所有孕鼠數(shù)及每只孕鼠的著床胚泡數(shù)，計算妊娠率和平均胚泡著床數(shù)；采用化學(xué)發(fā)光法檢測促排卵組和對照組的血清及子宮組織雌二醇、孕酮的含量，利用光鏡觀察子宮內(nèi)膜及卵巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 2.圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中OPN和整合素p3蛋白和基因檢測 將清潔級性成熟期昆明小鼠44只

5、，雌性24只，雄性20只，雌性小鼠陰道涂片檢查為動情前期，在此期注射PMSG和HCG，4只雌鼠不合籠，用頸椎脫臼法處死，剪取子宮組織(孕DO，對照組)，直接液氮保存和福爾馬林固定保存，其余的雌：雄小鼠1：1合籠，次日檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓計為妊娠第1天。分別于妊娠第4天，5天，6天，7天，8天用頸椎脫臼法處死，迅速剖腹，剪取子宮組織予以保存(實驗組)，采用免疫組化方法和Western-blotting技術(shù)分析圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中的骨橋蛋白

6、和整合素p3表達(dá)規(guī)律，采用RT-PCR技術(shù)半定量分析圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜骨橋蛋白和整合素p3 mRNA表達(dá)特征。 3.OPN抗體和整合素β3抗體對小鼠胚泡著床的影響 取孕4天小鼠，分別在兩側(cè)子宮角內(nèi)注射骨橋蛋白抗體、整合素β3抗體及生理鹽水，正常妊娠空白對照組未行任何處理，于孕8天處死小鼠，統(tǒng)計胚泡著床數(shù)及妊娠率，取子宮觀察內(nèi)膜的組織學(xué)變化。 結(jié)果： 1.用PMSG+HCG建立小鼠早期妊娠模型

7、PMSG+HCG組妊娠率為90％，平均胚泡著床數(shù)9.5±3.6；對照組妊娠率為60％，平均胚泡著床數(shù)3.8±3.9，促排卵組妊娠率和平均胚泡著床數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)；促排卵組小鼠血清和子宮組織中的雌二醇和孕酮含量高于對照組，P<0.05;兩組小鼠子宮內(nèi)膜的形態(tài)變化沒有差異。 2.圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中的OPN和整合素β3的表達(dá) 小鼠整個圍植入期子宮內(nèi)膜中均有OPN和整合素p3表達(dá)，但表達(dá)的高峰在著床窗口期，即

8、孕D5。孕DO(非孕)子宮內(nèi)膜的OPN和整合素p3表達(dá)較弱，孕D4時表達(dá)增強，孕D5時表達(dá)最強，孕D6時表達(dá)突然回落，孕D7、孕D8時表達(dá)減弱，降至非孕水平。 3.骨橋蛋白抗體和整合素p3抗體抑制胚胎著床 結(jié)果顯示骨橋蛋白抗體組小鼠妊娠率為60％，平均胚胎著床數(shù)為1.6±1.19，整合素p3抗體組妊娠率為70％，平均胚胎著床數(shù)為1.7±1.28，明顯低于生理鹽水組及空白對照組(90％，10.0±1.63及100％，10.

9、5±1.58)，提示骨橋蛋白抗體和整合素p3抗體明顯抑制小鼠胚泡著床。 結(jié)論： 1.注射PMSG和HCG可有效介導(dǎo)小鼠早期妊娠模型的建立，妊娠率和胚泡著床數(shù)明顯高于自然條件受孕，該模型的建立為進(jìn)一步研究胚泡著床及子宮內(nèi)膜容受性等提供理想的技術(shù)平臺。 2.骨橋蛋白和整合素p3在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)隨著孕齡的增加逐漸增強，但表達(dá)的高峰在孕D5，與植入窗的開放相吻合，是子宮內(nèi)膜接受性的客觀標(biāo)志，提示骨橋蛋白和整