LPAR3、COX-2和VEGF蛋白在反復(fù)移植失敗患者著床期子宮內(nèi)膜表達的研究.pdf

1、背景及意義:
　　三十年來，體外受精一胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET)技術(shù)飛速發(fā)展。胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是助孕技術(shù)成功與否的兩大關(guān)鍵因素。隨著胚胎實驗室技術(shù)的日趨完善和臨床超促排卵方案的不斷優(yōu)化，胚胎質(zhì)量得到很大提高。但胚胎移植成功率仍然徘徊在一個較低的水平。因此，子宮內(nèi)膜容受性的問題日趨受到重視。子宮內(nèi)膜容受性指子宮內(nèi)膜在較短時期內(nèi)對胚胎具有一個接受能力，這

2、通常發(fā)生月經(jīng)周期的第19～24天，稱為“種植窗期”。有報道稱超過半數(shù)的移植失敗是由于子宮內(nèi)膜容受性降低導(dǎo)致。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，既往周期中移植次數(shù)超過3次或者移植優(yōu)質(zhì)胚胎總數(shù)大于10個仍未能成功妊娠，被稱為胚胎反復(fù)移植失敗(RIF)。目前，對RIF的研究主要集中在子宮內(nèi)環(huán)境，卵巢分泌的甾體激素，自身免疫，輸卵管因素以及心理因素等方面導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜容受性缺陷上，但是至今仍無法有效解決反復(fù)移植失敗這一臨床問題。反復(fù)移植失敗給患者帶來巨大的經(jīng)濟壓力

3、和精神壓力。
　　子宮內(nèi)膜容受性的建立是由一系列甾體激素、黏附蛋白、細(xì)胞因子協(xié)同作用的結(jié)果。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胚胎種植過程與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移極為相似。溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid，LPA)具有生長因子樣作用，可以特異性結(jié)合靶器官上的受體，發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)。在已知的6種受體中，LPAR3受體與雌性生殖最為密切相關(guān)，主要存在于女性卵巢、胎盤、子宮內(nèi)膜等組織。有研究通過敲除雌性小鼠LPAR3基因，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜前

4、列腺素、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)的表達均降低，同時出現(xiàn)胚胎種植延遲，在給予外源性前列腺環(huán)素類藥物后，雌小鼠胚胎種植延遲得以改善，這提示LPAR3-COX2-PGS下游信號途徑調(diào)節(jié)胚胎種植。國內(nèi)亦有研究發(fā)現(xiàn)LPAR3在整個女性月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上均有表達。而與子宮內(nèi)膜血管化關(guān)系最密切的調(diào)節(jié)因子血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)受COX-2合成的PG

5、s調(diào)控。PGE2可以通過雌孕激素受體激活相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)VEGF的表達。胚胎著床部位子宮內(nèi)膜血管網(wǎng)的建立和子宮內(nèi)膜蛻膜化的發(fā)生，是囊胚得以成功黏附的重要條件。那么反復(fù)移植失敗患者著床期子宮內(nèi)膜中LPAR3、COX-2和VEGF表達如何，是否與此類患者子宮內(nèi)膜容受性受損有關(guān)，本課題將就這一問題進行初步研究。
　　本實驗選取鄭大一附院生殖中心反復(fù)移植失敗患者為研究對象，通過研究其子宮內(nèi)膜種植窗期LPAR3、COX-2、VEGF

6、蛋白的表達和相關(guān)性，為研究子宮內(nèi)膜容受性提供理論依據(jù)，以改善RIF患者臨床妊娠率。
　　研究目的:
　　通過檢測LPAR3、COX-2和VEGF在RIF患者種植窗期子宮內(nèi)膜上的定位與表達，探索反復(fù)移植失敗患者子宮內(nèi)膜容受性受損的機制，為改善子宮內(nèi)膜容受性提高胚胎種植率提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　選取2014年1月至2014年3月期間即將在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET/ICSI-ET/Th

7、aw-ET助孕患者，選取有助孕妊娠史擬再次助孕者為對照組，選取3個及以上周期均有優(yōu)質(zhì)胚胎移植或移植大于等于10枚優(yōu)質(zhì)胚胎仍未妊娠者為實驗組，納入標(biāo)準(zhǔn)(1)基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常(2)月經(jīng)規(guī)律，28～35天(3)近3個月內(nèi)未使用甾體激素(4)宮腔鏡等輔助檢查證實宮腔形態(tài)正常，無子宮畸形、內(nèi)膜息肉等(5)無染色體疾病、無免疫性疾病、非傳染病活動期等。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者均于月經(jīng)第21～22天擬建病例日抽取血清孕酮值(P)，確定其處于黃體期后行內(nèi)膜活檢

8、，內(nèi)膜活檢日空腹抽取血清雌二醇(E2)，并測量子宮內(nèi)膜厚度。收集內(nèi)膜后，部分標(biāo)本投入95％酒精送常規(guī)病理，剩余標(biāo)本分為兩份，一份用于4％多聚甲醛固定，行免疫組化檢測，一份用生理鹽水沖洗后立即置入-80℃冰箱冷凍保存，行westernblot。數(shù)據(jù)分析采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化結(jié)果顯示，LPAR3、COX-2及VEGF在兩組種植窗期子宮內(nèi)膜中均有表達，表達部位以子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞為主，LPA

9、R3、COX-2還在子宮內(nèi)膜腔上皮及部分基質(zhì)細(xì)胞中有表達，而VEGF則在部分表達在間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞包漿中。三者的平均光密度值比較，RIF組顯著低于對照組，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示，兩組內(nèi)膜中均檢測到LPAR3、COX-2和VEGF，但在RIF組的表達顯著小于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（LAR3:0.354±0.053VS0.279±0.041,P＜0.01;COX-2:0.

10、571±0.087VS0.165±0.022,P＜0.01;VEGF:0.627±0.096VS0.313±0.045,P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.LPAR3在著床期子宮內(nèi)膜上的表達部位和特點與反應(yīng)子宮內(nèi)膜容受性的VEGF一致，可作為潛在的預(yù)測子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物。
　　2.LPAR3、COX-2及VEGF在RIF患者著床期子宮內(nèi)膜中表達均下降，提示RIF患者子宮內(nèi)膜容受性降低，這可能是胚胎反復(fù)種植失敗的原