CREG通過p38-JNK絲裂原活化蛋白激酶信號通路調(diào)控血管平滑肌細胞凋亡.pdf

1、研究背景和目的：
　　細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。凋亡是細胞在一系列凋亡誘導因素的作用下，相關的凋亡信號通路被激活，使凋亡調(diào)節(jié)基因的表達發(fā)生改變，進而在Ca2+、Mg2+的參與下激活相關酶而啟動的。近年研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞（VSMCs）作為構(gòu)成血管壁的重要成分，其凋亡參與了動脈粥樣硬化（AS）及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄（RS）、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程

2、。VSMCs凋亡是AS和血管成形術(shù)后RS的重要病理特征，提示細胞凋亡在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了重要作用。因此，有關VSMCs凋亡的研究已經(jīng)成為心血管疾病防治研究的熱點，深入探討調(diào)控VSMCs凋亡的分子機制具有重要的臨床意義，可能成為預防AS進展和PCI術(shù)后RS的有效策略。
　　E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-activated genes，CREG）是新近發(fā)現(xiàn)的一種分泌型糖蛋白，在組織

3、和細胞發(fā)育中起重要作用。已有研究表明，CREG蛋白在成熟的組織和細胞中高表達，而在未成熟的細胞如干細胞、人畸胎瘤細胞及未分化的VSMCs中呈低表達，說明CREG對于維持機體細胞和組織的成熟和穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。我室前期研究發(fā)現(xiàn)CREG過表達能夠?qū)归L期血清饑餓誘導的VSMCs凋亡，而抑制CREG表達后，細胞不耐受去血清培養(yǎng)而發(fā)生大量凋亡。本研究以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染CREG過表達及表達抑制的人VSMCs和球囊損傷的人胸廓內(nèi)動脈（ITA）為

4、研究對象，深入探討CREG在調(diào)控人VSMCs凋亡中的作用及相關分子機制，以期為PCI術(shù)后RS的防治提供新的思路和治療方法。
　　材料和方法：
　　我們首先應用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，分別將過表達hCREG的pLNCX2-CREG和能夠沉默hCREG表達的pSM2-siCREG感染體外培養(yǎng)的人VSMCs。通過抗性藥物篩選，獲得能夠穩(wěn)定傳代的hCREG過表達細胞株（hVSMCs-CREG）和hCREG表達抑制的細胞株（hVSMCs-si

5、CREG）。Westernblot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的CREG表達，為進一步探討CREG調(diào)控VSMCs凋亡等生物學行為提供研究平臺。
　　應用已構(gòu)建的CREG過表達和表達抑制的hVSMCs，分別給予凋亡誘導劑斯托斯普林（Staurosporine，STS）和依托泊苷（Etoposide，VP-16）誘導細胞凋亡，采用Westernblot、流式細胞計數(shù)和TUNEL染色等實驗方法檢測細胞凋亡情況和相關信號通路變化。并通過細胞瞬時轉(zhuǎn)染

6、和添加有關信號通路抑制劑進一步明確CREG調(diào)控細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路。
　　在體外實驗的基礎上，選擇患冠心?。–AD）并行冠脈搭橋手術(shù)病人的ITA建立球囊損傷模型，在球囊損傷和外源性添加CREG蛋白干預后的不同時間點收取受損動脈段。采用蘇木精-曙紅染色觀察CREG和細胞凋亡標志物cleavedcaspase-3變化情況。Westernblotting檢測CREG、VSMCs分化及凋亡指標和相關信號通路的變化。并給予特異性信號通路抑

7、制劑，進一步明確在血管組織急性損傷的情況下CREG調(diào)控細胞凋亡的信號通路。
　　研究結(jié)果：
　　1、CREG過表達促進VSMCs分化，抑制細胞凋亡
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒介導CREG基因表達前后三種hVSMCs的形態(tài)學發(fā)生變化：pLNCX(＋)/GFP穩(wěn)定感染細胞（Ctlcells）呈典型的波峰波谷樣生長；CREG過表達細胞（CREG-SNcells）體積變小且更加細長，易于環(huán)繞排列生長呈管腔樣結(jié)構(gòu)，細胞呈現(xiàn)典型的分化表型生長

8、；CREG表達抑制細胞（CREG-AScells）體積明顯增大，細胞失去極性呈無序樣生長。采用Westernblot檢測CREG-SN、Ctl和CREG-AS三種細胞的CREG表達及分泌情況。發(fā)現(xiàn)CREG-SN細胞胞漿中CREG的表達與Ctl細胞無明顯差別，而培養(yǎng)上清中表達較Ctl細胞明顯增加。CREG-AS細胞與前兩組細胞比較，培養(yǎng)上清及胞漿中CREG的表達明顯降低（P<0.01）。
　　分別選擇不同濃度的STS（50、100、

9、200nmol/L）、VP-16（20、50、100μmol/L）作用于CREG-AS細胞，在不同時間點（0、4、8、12、24h）收集細胞。AnnexinV/PI雙染色流式細胞分析顯示：不同濃度的STS和VP-16對細胞凋亡均有作用，且其誘導細胞凋亡的效應具有時間和濃度依賴性，即隨濃度增加和時間延長，細胞凋亡的效應越明顯。其中STS200nmol/L和VP-16100μmol/L誘導細胞凋亡的效果最為明顯。
　　CREG-SN、

10、Ctl和CREG-AS細胞分別在有效濃度的STS和VP-16誘導下，通過Westernblot檢測CREG、細胞分化和凋亡指標表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VSMCs分化標記物SMα-actin和SMMHC的表達趨勢與CREG相似，而凋亡標志物cleavedcaspase-3及細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）和層粘連蛋白（Laminin-1，LN）與CREG表達趨勢相反。同時發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用時間延長，在CREG表達抑制組，cl

11、eavedcaspase-3的增高更明顯，SMα-actin和SMMHC的減少更為突出，而CREG過表達明顯抑制了細胞凋亡標志物的表達，分化指標表達水平卻相對較高。Annexin-V/PI雙染流式分析和TUNEL染色也發(fā)現(xiàn)CREG過表達明顯抑制細胞凋亡。以上結(jié)果提示，CREG過表達在維持hVSMCs分化狀態(tài)的同時，抑制其凋亡。
　　2、CREG通過p38/JNK信號通路調(diào)控VSMCs凋亡
　　三種細胞在STS和VP-16作用

12、下，在不同時間點，采用Westernblot檢測細胞凋亡有關的信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化的p38、JNK和Akt均有增高趨勢。然后在分別給予信號通路抑制劑SB203580、SP600125和LY294002預處理的基礎上，誘導細胞凋亡。通過Annexin-V/PI流式分析，發(fā)現(xiàn)p38/JNK信號通路參與調(diào)控了VSMCs凋亡，而PI3K?Akt信號通路無明顯作用。為進一步明確p38信號通路在CREG調(diào)控VSMCs凋亡中的作用，在CREG-A

13、S細胞中瞬時轉(zhuǎn)染p38表達抑制腺病毒質(zhì)粒和給予特異性p38抑制劑，通過流式分析和Westernblot分析進一步明確了p38在細胞凋亡中的作用，同時也發(fā)現(xiàn)在p38活化的同時，進一步激活了JNK，兩者在調(diào)控VSMCs凋亡中存在協(xié)同作用。
　　3、在急性損傷的動脈模型中，CREG促進VSMCs分化，同時通過p38/JNK信號通路抑制細胞凋亡
　　體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在人ITA球囊損傷修復過程中CREG表達與VSMCs分化狀態(tài)相關。We

14、sternblot結(jié)果顯示，CREG在AS組織中低度表達，在球囊損傷后7d，CREG表達下降，到第14d和28d表達略升高，始終維持在低表達水平。VSMCs分化標記物SMα-actin和SMMHC的表達趨勢與CREG相似，而細胞凋亡標記物cleavedcaspase-3與CREG表達趨勢相反。在給予CREG蛋白干預后血管中CREG維持在高表達水平，SMα-actin和SMMHC也明顯增加并維持在高度表達水平，而cleavedcaspas

15、e-3表達明顯下降。免疫組織化學結(jié)果顯示cleavedcaspase-3在球囊損傷后28d明顯增高，而在給予CREG蛋白干預后，其表達水平明顯下降。HE染色也顯示在球囊損傷后28d新生內(nèi)膜明顯增厚，而CREG蛋白干預后，明顯抑制了損傷后新生內(nèi)膜的形成。以上結(jié)果提示在血管組織急性損傷修復過程中CREG可能在促進VSMCs分化，抑制細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。
　　Westernblot也顯示，在急性損傷后，盡管總的p38、JNK和Ak

16、t表達沒有明顯改變，但在損傷后14d磷酸化的p38、JNK和Akt表達明顯增加。在外源性添加不同濃度的CREG蛋白干預后，p38、JNK和Akt活化形式的表達量明顯減低。與此同時，分別給予p38、JNK和Akt信號通路抑制劑，結(jié)果顯示在p38抑制劑組中磷酸化的p38和JNK表達均明顯下降，在JNK抑制劑組中磷酸化形式的JNK明顯減少，而p38的活化亦有所減低。同時發(fā)現(xiàn)p38和JNK抑制劑組中細胞凋亡指標cleavedcaspase-3表