Sterile-20激酶MINK1調(diào)控血小板功能并參與止血和血栓形成的機(jī)制研究.pdf

1、血小板在生理止血和血栓形成中扮演了重要角色，血小板的功能不足會(huì)導(dǎo)致出血，而血小板過(guò)度活化則會(huì)引起血栓性疾病。因此對(duì)血小板活化分子機(jī)理的深入研究，能夠闡明出血或血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制，并為該類疾病尋求新的治療靶點(diǎn)和策略。在血小板活化過(guò)程中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)作為重要的信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)分子，參與調(diào)控血小板粘附、釋放、聚集等各項(xiàng)功能，以促進(jìn)血栓的形成。經(jīng)典的MAPK通路是包含三個(gè)激酶的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，MAP3K磷酸化激活MAP2K，MAP

2、2K再磷酸化激活MAPK。然而，在血小板信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中對(duì)MAPK通路具體的細(xì)致調(diào)控還不清楚。以往研究表明，Sterile-20激酶在信號(hào)通路中能夠扮演MAP4K的角色來(lái)調(diào)控MAPK通路的活化。Sterile-20激酶超家族根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為兩大家族:p21活化激酶(PAK)家族和生發(fā)中心激酶(GCK)家族。MINK1屬于GCKⅣ亞家族，在2000年被首次報(bào)道，在多種細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并能夠作為MAP4K參與調(diào)控Ras致癌基因誘導(dǎo)的卵巢

3、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制以及T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的陰性選擇。MINK1在止血與血栓領(lǐng)域的作用在此之前未見報(bào)道，鑒于MAPK通路在血小板活化以及血栓形成中的作用，我們提出假設(shè):MINK1能夠通過(guò)調(diào)控MAPK來(lái)介導(dǎo)血小板活化，并參與止血和血栓形成過(guò)程。
　　本研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，首次研究了MINK1在血小板功能，止血以及血栓形成中的作用。結(jié)果可以概括為以下幾點(diǎn):
　　(1)在小鼠出血實(shí)驗(yàn)中，MINK1敲除小鼠尾部出血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明M

4、INK1的缺失使得小鼠止血功能受損。
　　(2)在三氯化鐵誘導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈血栓模型中，MINK1敲除小鼠的動(dòng)脈堵塞時(shí)間顯著延長(zhǎng)，兩倍于野生型小鼠。我們通過(guò)體外全血微灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)M血栓形成，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈流速條件下，MINK1缺失血小板在膠原表面形成的血栓面積明顯減小，證明MINK1對(duì)血栓形成的正向促進(jìn)作用依賴于其在血小板中發(fā)揮的作用。
　　(3)在對(duì)血小板各項(xiàng)功能進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，MINK1的缺失不影響血小板在膠原表面的粘附，然而當(dāng)用

5、低濃度膠原和凝血酶刺激血小板發(fā)生聚集時(shí)，MINK1的缺失使得血小板的聚集水平顯著降低，并且伴隨有致密顆粒的釋放障礙，但是血小板α顆粒的釋放以及血栓烷A2的合成并不受MINK1缺失的影響。另外，MINK1缺失血小板在纖維蛋白原表面的鋪展面積較野生型血小板明顯減小，但是其血塊回縮功能則表現(xiàn)正常。
　　(4)當(dāng)繼發(fā)釋放的ADP被apyrase水解后，野生型血小板與MINK1缺失血小板在聚集和鋪展功能上的差異基本消失，并且，外源性補(bǔ)充AD

6、P能夠使MINK1缺失血小板的聚集和鋪展功能恢復(fù)到正常水平。因此，MINK1的缺失導(dǎo)致的ADP分泌減少是血小板聚集和鋪展功能發(fā)生障礙的原因。
　　(5)在分子機(jī)制研究方面，我們發(fā)現(xiàn)MINK1的缺失不影響整合素αⅡbβ3的由內(nèi)向外和由外向內(nèi)信號(hào)本身，而在低濃度膠原和凝血酶所誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)中，MINK1的缺失使得ERK，p38和Akt的磷酸化水平顯著降低，且MINK1對(duì)上述分子的調(diào)控不依賴于繼發(fā)釋放的ADP以及整合素αⅡbβ3介導(dǎo)的由

7、外向內(nèi)信號(hào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MINK1也能夠調(diào)控ERK和p38上游的MAP2K分子—MEK1/2和MKK3/6的活化。在用ERK抑制劑U0126或p38抑制劑SB203580孵育血小板后發(fā)現(xiàn)，它們能夠消除野生型血小板與MINK1缺失血小板在應(yīng)對(duì)低濃度膠原和凝血酶刺激時(shí)聚集和致密顆粒釋放上的差異，說(shuō)明MINK1缺失導(dǎo)致的ERK和p38磷酸化水平的降低，是致密顆粒釋放減少以及聚集受損的原因。
　　綜上所述，MINK1是參與血小板活化以