趨化因子CCL2參與調(diào)控血小板活化及動脈血栓形成的相關(guān)研究.pdf

1、背景和目的：急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中最危重的類型，也是心血管疾病致死的頭號殺手。及早明確AMI的診斷，迅速恢復堵塞的冠脈血流，挽救缺血的心肌至關(guān)重要。近年來，經(jīng)皮冠脈介入治療后，長期的抗血小板治療已成為AMI的主要治療手段之一。氯吡格雷和阿司匹林是常用的抗血小板藥物。然而，越來越多的臨床研究表明，常規(guī)應用抗血小板藥物，甚至加大服藥劑量或更換新型抗血小板藥物替格瑞洛后，仍有一

2、部分患者出現(xiàn)氯吡格雷抵抗或殘余血小板高反應。這部分患者發(fā)生不良心血管事件的風險也明顯增加。因此，尋找參與殘余血小板聚集和活化且與患者預后相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控分子及信號通路是亟待解決的問題。
　　CC趨化因子配體2(chemokine C-C motif2，CCL2)，又稱單核細胞趨化蛋白1，是炎癥反應中的啟動因子，通過正反饋作用誘導其它炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，加速動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的進展。有研究表明，血漿

3、中CCL2高表達的急性冠脈綜合征患者發(fā)生心血管終點事件的風險明顯高于CCL2低表達的患者。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，CCL2在ST段抬高型心肌梗死(ST elevation myocardial infarction，STEMI)患者血漿中和血小板內(nèi)的表達均明顯高于對照組。CCR2是CCL2的特異性受體，是含有7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體。CCL2通過與CCR2結(jié)合后在AS及AMI發(fā)展的多個階段如脂質(zhì)條紋形成、斑塊破裂、血栓形成中均發(fā)揮作用。然

4、而，CCL2是否通過影響殘余血小板的聚集和活化而參與動脈血栓形成，以及具體通過何種機制調(diào)控血小板，目前未見相關(guān)報道。
　　基于上述研究背景，我們在本研究中首先探討了服用替格瑞洛的STEMI患者血漿中CCL2表達的差異及其與殘余血小板聚集率(residual platelet agglutination，RPA)的相關(guān)性，患者血小板中CCL2和CCR2的表達差異，以及血漿中CCL2水平與患者預后的相關(guān)性。其次分別以健康志愿者及小鼠為

5、研究對象，應用蛋白芯片篩選并用Western Blot驗證了CCL2對血小板中信號通路的調(diào)控。最后探討了CCL2對小鼠血小板聚集、顆粒分泌和動脈血栓形成的影響。以明確CCL2是否參與殘余血小板的活化及其具體調(diào)控機制，并驗證CCL2是否參與了動脈血栓形成，為AMI等血栓性疾病的研究提供新思路。
　　方法和結(jié)果：
　　1.CCL2參與STEMI患者殘余血小板活化并與患者1年內(nèi)發(fā)生主要心腦血管不良事件(major adverse

6、cardiac and cerebral events，MACCE)獨立相關(guān)。
　　1)本部分共入選420例STEMI患者。采集80例服用替格瑞洛STEMI患者臨床基線資料，光比濁法檢測患者服藥后不同時間點(2h、4h、6h)的RPA并分組，比較殘余血小板正常反應組(正常反應組)和殘余血小板高反應組(高反應組)患者臨床基線資料。各指標在正常反應組和高反應組之間比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。服藥后2h、4h、6h的殘余血小板高

7、反應比例分別為43.8％、28.8%、17.5%。應用Verifynow法檢測患者服藥后2h、4h、6h的P2Y12反應單位并分組，殘余血小板高反應比例分別為34.8%、24.6%、14.3%。
　　2)按照RPA結(jié)果分組，應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測正常反應組和高反應組患者血漿中CCL2濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：服藥后不同時間點高反應組患者血漿中CCL2濃度(

8、2h：209.72±84.09pg/ml；4h：195.54±63.66pg/ml；6h：184.29±56.74pg/ml)均明顯高于正常反應組患者(2h：167.52±36.92pg/ml；4h：160.63±42.31pg/ml；6h：152.43±42.48pg/ml，P＜0.01或P＜0.05)。將患者服藥后不同時間點的RPA與各時間點相應的血漿中CCL2濃度進行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：服藥后2h、4h、6h患者的R

9、PA值與血漿中CCL2濃度之間均存在線性關(guān)系(r=0.474，r=0.622，r=0.425，P＜0.01)。
　　3)根據(jù)患者服用替格瑞洛后2h的RPA值分組，選擇正常反應組患者和高反應組患者各5例。應用Western Blot方法檢測正常反應組和高反應組患者血小板中CCL2和CCR2表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高反應組患者血小板中CCL2及CCR2的表達均明顯高于正常反應組(P＜0.01)。
　　4)應用ELISA檢測入選的全部42

10、0例STEMI患者入院即刻血漿中CCL2濃度，并對全部患者進行1年隨訪，比較發(fā)生MACCE與未發(fā)生MACCE患者血漿中CCL2濃度的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1年內(nèi)總體MACCE發(fā)生率為8.8%(37/420)。發(fā)生MACCE的STEMI患者血漿中CCL2濃度(244.56±105.85pg/ml)明顯高于未發(fā)生MACCE的患者(190.65±50.72pg/ml，P＜0.01)；其中發(fā)生全因死亡、心衰、腦梗塞、再發(fā)心梗的患者血漿中CCL2濃度(

11、237.39±107.79pg/ml、267.39±160.56pg/ml、254.90±91.40pg/ml、240.38±90.13pg/ml)均明顯高于未發(fā)生MACCE患者(P＜0.01或P＜0.05)；<24h及24h-90d發(fā)生MACCE患者血漿中CCL2濃度(269.83±115.27pg/ml、251.25±132.74pg/ml)明顯高于未發(fā)生MACCE患者(P＜0.01)。
　　5)按照420例STEMI患者血漿

12、中CCL2的中位數(shù)濃度分組，比較兩組患者臨床基線資料和MACCE發(fā)生率。應用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，Cox生存回歸分析血漿中CCL2濃度與MACCE之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血漿中CCL2的中位數(shù)濃度為179.89pg/ml，CCL2濃度>179.89pg/ml的患者年齡、總體MACCE發(fā)生率及腦梗塞的發(fā)生率明顯高于CCL2濃度≤179.89pg/ml的患者(P=0.000，P=0.009，P=0.030)。血漿中C

13、CL2濃度與患者1年內(nèi)發(fā)生的MACCE獨立相關(guān)(HR=1.008，P=0.000)。
　　2.CCL2因子可以通過血小板內(nèi)P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK)-熱休克蛋白27(heat shock protein27，HSP27)信號通路調(diào)控血小板。
　　1)本部分入選20例健康志愿者。收集8例健康志愿者血小板，應用CCL2因子(1000ng/ml)刺

14、激其中4例志愿者的血小板，另外4例志愿者的血小板作為對照。通過蛋白芯片檢測經(jīng)CCL2因子刺激的血小板內(nèi)發(fā)生磷酸化變化的激酶。接下來，收集入選的20例健康志愿者的血小板，應用CCL2因子(1000ng/ml)刺激人血小板；或者分別應用CCL2中和抗體(50μg/ml)、CCR2拮抗劑RS201895(10μM)、P38MAPK信號通路抑制劑SB203580(10μM)預處理后，再應用CCL2因子刺激血小板。通過Western Blot方法

15、檢測芯片篩選的激酶磷酸化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蛋白芯片共篩選出12種激酶磷酸化位點的磷酸化表達明顯升高(P＜0.05)，并且通過Western Blot驗證了CCL2因子刺激后血小板內(nèi)P38MAPK(T180/Y182)和HSP27(S78/S82)的磷酸化表達明顯高于對照組(P＜0.01)，這種作用可以分別被CCL2中和抗體、RS201895或SB203580抑制(P＜0.01)。
　　2)選取野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠各1

16、0只，應用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP，10μM)或者膠原(5μg/ml)刺激小鼠血小板，通過Western Blot方法檢測野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板內(nèi)P38MAPK(T180/Y182)和HSP27(S78/S82)的磷酸化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無論是ADP或者膠原誘導后，CCL2-/-小鼠血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27的磷酸化水平均明顯低于野生型C57小鼠(P＜0.05)。
　

17、　3.CCL2參與小鼠血小板聚集、顆粒分泌和動脈血栓形成。
　　1)選取野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠各10只，應用ADP或膠原刺激血小板，光比濁法檢測野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板聚集率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)ADP(10μM、20μM)體外刺激后，CCL2-/-小鼠血小板聚集率均明顯低于野生型C57小鼠(P＜0.05)。經(jīng)膠原(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)體外刺激后，CCL2-/-小鼠血小板聚集率均明顯

18、低于野生型C57小鼠(P＜0.05)。
　　2)選取野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠各10只，應用ADP或膠原刺激血小板，ELISA檢測野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板顆粒分泌CD40L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)不同濃度的ADP或膠原體外刺激后，CCL2-/-小鼠血小板顆粒分泌CD40L均較野生型C57小鼠明顯降低(P＜0.05)。
　　3)應用ADP或膠原刺激血小板后，ELISA檢測野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血

19、小板顆粒分泌PF4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)不同濃度的ADP或膠原體外刺激后，CCL2-/-小鼠血小板顆粒分泌PF4均較野生型C57小鼠明顯降低(P＜0.05)。
　　4)應用血細胞分析儀檢測小鼠血液中血小板和白細胞計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCL2-/-小鼠和野生型C57小鼠血液中血小板和白細胞計數(shù)無明顯差異(P＞0.05)。
　　5)應用手術(shù)刀在距離小鼠尾尖2mm處剪斷小鼠鼠尾，觀察野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠平均鼠尾出血時間。結(jié)果發(fā)

20、現(xiàn)：CCL2-/-小鼠鼠尾平均出血時間(9.55±3.36min)較野生型C57小鼠明顯延長(7.27±2.67min，P＜0.05)。
　　6)應用凝血酶(1U/ml)刺激小鼠富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，觀察野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血凝塊形成后的回縮。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：凝血酶刺激小鼠PRP后30min、60min、120min，CCL2-/-小鼠血凝塊回縮均較野生型C57小鼠緩慢(P＜

21、0.05)。
　　7)應用10%三氯化鐵外敷小鼠頸總動脈外膜，制備小鼠頸總動脈血栓模型。應用小動物超聲探頭監(jiān)測小鼠頸總動脈血流變化，觀察野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠頸總動脈閉合時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCL2-/-小鼠頸總動脈平均閉合時間(13.01±6.21min)較野生型C57小鼠明顯延長(9.20±3.32min，P＜0.05)。
　　結(jié)論：本課題初步揭示了CCL2參與殘余血小板活化并且可以通過血小板內(nèi)P38MAPK-