趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25在肝纖維化和肝硬化病人肝組織中的表達變化.pdf

1、骨髓源性肝干細(xì)胞(Bone marrow derived liver stem cells,BMDLSC)是指骨髓干細(xì)胞中可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群。這類干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。小鼠BMDLSC移植實驗證實,BMDLSC對CCL4及酒精所致小鼠肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)作用。但是在生理狀態(tài)下定居在骨髓內(nèi)的BMDLSC,為什么在移植后會向肝臟遷移并發(fā)揮修復(fù)作用,調(diào)控移植后BMDLSC向肝臟遷移的因素又有哪些,它們又是

2、如何調(diào)控BMDLSC向肝臟遷移的,這些問題目前都未明了。
　　 近些年來,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)趨化因子有可能是驅(qū)使BMDLSC向肝臟遷移的一個重要因素,其中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)已在動物實驗中證實可以驅(qū)使CXCR4陽性的骨髓源性肝干細(xì)胞向肝內(nèi)聚集并誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化[1],我們此前的臨床研究[2]也觀察到SDF-1α在肝臟發(fā)生纖維性增生時表達增多,并且表達數(shù)量與肝纖維化程度相關(guān),提示SDF-1α在人體內(nèi)同樣有可能

3、是趨勢BMDLSC向肝臟遷移的一個重要因素。在體外試驗中,單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1,系統(tǒng)命名為CCL2)[3,4]、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達和分泌因子(Rantes,系統(tǒng)命名為CCL5)[4-6]、人單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3,系統(tǒng)命名為CCL7)[7]、人二級淋巴組織趨化因子(SLC,系統(tǒng)命名為CCL21)[8]和人胸腺表達趨化因子(TECK,系統(tǒng)命名為CCL25)[4,9]等趨化因子可以驅(qū)使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向其濃度遞增方

4、向遷移,且趨化能力大小與上述趨化因子的濃度成正相關(guān)。提示這些趨化因子在體內(nèi)也有可能是調(diào)控BMDLSC向肝臟遷移的的因素。但是,趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CC125在肝臟的表達情況至今仍未見報道。
　　 本實驗采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對正常肝組織和肝纖維化與肝硬化肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的

5、表達水平進行了檢測。方法參照人ELISA試劑盒內(nèi)所附的操作說明。結(jié)果顯示,肝臟發(fā)生肝纖維性增生損傷時,肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的含量顯著增加,隨著病變由肝纖維化向肝硬化發(fā)展,肝組織中CCL2、CCL5、CCL21和CCL25水平也進一步升高,但CCL7水平呈下降趨勢。
　　 [材料和方法]
　　 1.肝組織 取自30例病人,均來自2008年5月～2009年5月在南方醫(yī)科大學(xué)南方

6、醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)(包括肝移植)的病人。其中男性17例,女性13例。年齡19～77歲,平均50歲。30例標(biāo)本共分為3組:
　　 ①正常對照組(n=9):乙肝表面抗原陰性,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能正常(轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、血清白蛋白、凝血酶原時間),Child-Pugh肝功能分級評估為A級,肝組織病理學(xué)檢查顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常。
　　 ②肝纖維化組(n=10):乙肝表面抗原陽性,有或無乙型肝炎病史,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能

7、正?；虍惓?Child-Pugh肝功能分級評估為A級,組織病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)纖維化組織增生,但無假小葉形成。
　　 ③肝硬化組(n=11):乙肝表面抗原陽性,有或無乙型肝炎病史,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能檢查輕度至重度異常,Child-Pugh肝功能分級評估為A～C級,病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)廣泛纖維組織增生,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,假小葉及再生結(jié)節(jié)形成。
　　 2.觀察指標(biāo)與方法
　　 2.1 臨床癥狀與體征 體查確認(rèn)患者

8、有無黃疸,有無肝掌與癡蛛痣,有無腹腔積液,有無肝性腦病,以及這些癥狀體征的程度。
　　 2.2影像學(xué)檢查 肝臟CT掃描和肝臟B型超聲檢查。
　　 2.3 實驗室檢查 乙肝兩對半、丙肝抗體試驗,手術(shù)當(dāng)天抽血查肝臟生化功能指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)、凝血酶原時間(PT)。
　　 2.4組織病理學(xué)檢查 肝組織經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟至水及HE

9、染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 2.5肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量的測定
　　 2.5.1 肝組織的勻漿、離心 精確稱重肝組織后移入微量手動玻璃勻漿器中于低溫環(huán)境中徹底勻漿,按比加入1×PBS緩沖液將勻漿組織沈下并轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中,在低溫高速離心機中以4℃、1000×g離心力離心10min,提取上清液移至另一1.5ml EP管中,再次于4℃下25000×rpm離心2

10、0min,取上清液待測。
　　 2.5.2 ELISA法測定以上五種趨化因子的含量 采用雙抗體夾心ELISA法,即將上述五種趨化因子與包被于酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合后,再結(jié)合生物素化相應(yīng)的趨化因子抗體,加入底物A和B進行顯色,在酶標(biāo)儀上讀取450nm的波長OD值,趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的濃度與分別與對應(yīng)的OD值成比,用SPSS統(tǒng)計軟件進行曲線擬合,得到擬合效果最佳的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,再計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

11、,最后求出標(biāo)本離心液中的趨化因子的濃度。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 最終計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。行×列表資料采用x2檢驗；多組均數(shù)比較,如方差齊性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較；如方差不齊,則采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較；相關(guān)分析數(shù)據(jù)總體符合雙變量正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示,不

12、符合雙變量正態(tài)分布的采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。所有統(tǒng)計分析中,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本研究的觀察結(jié)果表明,肝臟不僅有CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25表達,而且在肝臟發(fā)生纖維增生性損害時,肝內(nèi)表達這些趨化因子的數(shù)量顯著增加。隨著肝損傷程度的加重,肝內(nèi)趨化因子的含量逐步增加,至肝纖維化階段,肝內(nèi)CCL7的含量達到高峰。至肝硬化階段,肝內(nèi)CCL2、CCL5、CCL21、C

13、CL25的含量達到高峰。但是這些趨化因子在肝臟發(fā)生纖維性損傷時出現(xiàn)表達上調(diào)的意義及其在BMDLSC向肝臟遷移過程中的調(diào)控作用有待進一步探索。
　　 2.肝內(nèi)趨化因子的含量與肝功能指標(biāo)的相關(guān)分析表明:CCL2、CCL5、CCL21和CCL25在肝臟的表達數(shù)量與ALT和AST的變化呈顯著性正相關(guān),提示這四種趨化因子在肝臟的表達水平也可以作為判斷有無肝臟損傷的指標(biāo)。肝細(xì)胞受到損傷時,肝臟表達這四種趨化因子的表達數(shù)量增多；CCL7在肝臟

14、的含量雖然也與ALT和AST的變化呈正相關(guān),但相關(guān)系數(shù)僅0.337和0.380,提示CCL7在肝臟的含量高低與肝臟有無細(xì)胞損傷的關(guān)系不大,CCL7不能作為判斷有無肝臟損傷的指標(biāo)。
　　 3.CCL2、CCL5、CCL7、CCL21、CCL25這五種趨化因子之間的相關(guān)性分析顯示,CCL2、CCL5、CCL21、CCL25這四種趨化因子之間相關(guān)系數(shù)均在0.728以上,且具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示這四種趨化因子的表達機制可能存在相似之處；C