ccl2在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜組織中的差異表達(dá)

1、CCL2在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜組織中的差異表達(dá),江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科葉實(shí)明 關(guān)兵 徐英 冀德君,目錄,,,研究背景,相關(guān)研究,問題思考,研究內(nèi)容,研究結(jié)果,研究結(jié)論,研究背景,一、變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis, AR）是一種發(fā)病廣泛、呈全球蔓延的鼻腔過敏性疾病，嚴(yán)重困擾著人們生活、工作和學(xué)習(xí)。發(fā)病率在10%~25%之間，致病原因主要涉及環(huán)境及遺傳兩個方面，目前治療主要為抗過敏藥物治療為主。因而，2

2、010年修訂的《變應(yīng)性鼻炎及其對哮喘的影響》(allergic rhinitis and its impact on asthma，ARIA)將其定義為一種難于治愈但可以長期控制的疾病。1、AR發(fā)病需具備三個條件：1、特異性抗原：即引起機(jī)體免疫反應(yīng)的物質(zhì)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，而且可以與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生過敏反應(yīng)；2、特應(yīng)性個體：即所謂的過敏體質(zhì)，具有這種體質(zhì)的人其特應(yīng)性抗體形成能力及介質(zhì)細(xì)胞釋放活性介

3、質(zhì)的能力極強(qiáng)；分泌性IgA（SIgA）水平較低或者功能低下；3、特應(yīng)性抗原與特應(yīng)性抗體相遇。2、AR發(fā)病分為三階段：致敏階段、激發(fā)階段和效應(yīng)階段（見下圖）。,變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制圖,,,二、趨化因子（chemokines, chemoattractant cytokines ，CK）是能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動的小分子細(xì)胞因子。 1、絕大多數(shù)CK有4個保守的半胱氨酸（Cys），根據(jù)前兩個Cys的相對位置不同，可以分為CX3C、CX

4、C 、CC和C類趨化因子。 2、趨化運(yùn)動是指細(xì)胞向高濃度刺激物方向的定向運(yùn)動。,趨化因子、受體及靶細(xì)胞,,CC趨化因子的名稱、染色體定位及受體,,相關(guān)研究,1、2001年Fu-jikura發(fā)現(xiàn)組胺能誘導(dǎo)AR患者鼻黏膜中CCL類趨化因子(包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、Rantes)的表達(dá)，提示可能存在一個組胺-MCPs軸，在AR發(fā)病中起著重要作用。2、2005年國內(nèi)學(xué)者章如新在變應(yīng)性鼻炎基因表

5、達(dá)譜及相關(guān)基因研究中，通過基因芯片法檢測發(fā)現(xiàn)MCP-1(CCL2）、MCP-2(CCL8)、CCR3、CCR7等在變應(yīng)性患者鼻黏膜組織中高表達(dá)，認(rèn)為CCL2的作用包括激活CD4+和CD8+T細(xì)胞的趨化能力,促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞釋放組胺和白三烯,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子的產(chǎn)生,提高Th2的極化。,3、2009年在陳德華等一項(xiàng)關(guān)于"干擾素- γ誘 導(dǎo) 的單核因子、單核細(xì)胞趨化蛋白 -1 和轉(zhuǎn)化生長因子 -β1 在變應(yīng)性鼻炎的表達(dá)&q

6、uot;的研究中，用ELISA法檢測血清中三者含量時發(fā)現(xiàn)：變應(yīng) 性 鼻炎 患 者血 清 MCP-1濃度明顯高于健康對照組，推測：MCP-1既介導(dǎo)速發(fā)相反應(yīng)，促進(jìn)多種炎性介質(zhì)釋放；同時人鼻黏膜中的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可持續(xù)分泌MCP-1，并儲存于鼻黏膜中，引起嗜堿性粒細(xì)胞的組胺釋放，從而介導(dǎo)遲發(fā)相反應(yīng)，導(dǎo)致鼻黏膜慢性炎癥及高反應(yīng)性，使鼻部 癥狀反復(fù)持久發(fā)作。,,問題思考,CCL2與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病關(guān)系及具體作用途徑？考慮到AR是系統(tǒng)性過敏反

7、應(yīng)的鼻部表現(xiàn)（取AR患者部分鼻黏膜組織）。,,目的與方法,目的：明確趨化因子CCL2在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜組織中的差異表達(dá)并探討其在發(fā)病過程中的作用。方法： 收集2014年1月至2014年3月，江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院行手術(shù)治療的AR及單純鼻中隔偏曲患者，確定AR組患者嚴(yán)格按照AR(2009武夷山標(biāo)準(zhǔn)診斷標(biāo)準(zhǔn)納入。另選取入院行單純鼻中隔偏曲矯正的病人為正常對照組。全部病人術(shù)前詳細(xì)詢問病史，手術(shù)治療前3周內(nèi)均未用抗炎、抗組胺藥及

8、皮質(zhì)類固醇激素等藥物，行內(nèi)窺鏡檢查了解黏膜有無蒼白水腫、有無鼻息肉，行變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)測試確定是否有AR。其中AR組2例，正常對照組1例。本研究取材在取得患者本人知情同意的前提下進(jìn)行。病人資料如下:1號：性別，男；年齡，48歲；正常人（單純鼻中隔偏曲矯正患者）2號：性別，男；年齡，43歲；AR患者3號：性別，女；年齡，46歲；AR患者,技術(shù)手段,分別留取2例變應(yīng)性鼻炎手術(shù)者部分下鼻甲組織及1例正常鼻甲組織作為對照，Trizol

9、法組織總RNA運(yùn)用分光光度計(jì)檢測合格后（見表1），送公司進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄組測序，并進(jìn)行差異表達(dá)分析（基因差異表達(dá)分析，差異基因參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的顯著性分析，即KEGG數(shù)據(jù)庫）。,表1 組織總RNA濃度及純度檢測結(jié)果,生物信息分析流程圖,,質(zhì)量控制,在差異基因篩選中，我們選取FDR=2作為標(biāo)準(zhǔn)，即至少上調(diào)2倍或下調(diào)至少50%。（FDR表示錯誤發(fā)現(xiàn)率，它是通過對p-value進(jìn)行校正得到的，作為差異基因篩選取的關(guān)鍵指標(biāo)）,,結(jié)果,1.1

10、本實(shí)驗(yàn)其中一例實(shí)驗(yàn)組中獲得差異表達(dá)基因376條，與正常對照組相比，AR組253條基因至少上調(diào)2倍，123條基因下調(diào)至少50%；另一例實(shí)驗(yàn)組中獲得差異表達(dá)基因659條，與正常對照組相比，AR組274條基因至少上調(diào)2倍，385條基因下調(diào)至少50%（見表2）。,表2 樣品間的差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表,1.2 差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫對比分析,表3 細(xì)胞因子及受體相互作用通路中各差異表達(dá)因子及對應(yīng)RPKM值,細(xì)胞因子及受體相互作用通路（cyt

11、okine- cytokine receptor interaction）理解,細(xì)胞因子及受體相互作用滲透到AR的多個環(huán)節(jié)，如Thl／Th2失衡及二類細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)、AR的致敏及激發(fā)階段。本研究的IL-6高表達(dá)、IL-8的低表達(dá)與Thl／Th2失衡學(xué)說中Th2類細(xì)胞因子優(yōu)勢表達(dá)相符合。表皮生長因子（EGF）是一類廣泛存在于人和動物體內(nèi)、可促進(jìn)或抑制多類細(xì)胞生長的多肽，國內(nèi)有關(guān)研究提示EGF可促進(jìn)鼓膜纖維層血管增生以促進(jìn)鼓膜穿

12、孔的愈合；丁國強(qiáng)、鄭春泉的研究發(fā)現(xiàn)EGF和EGFR在慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中均有明顯表達(dá)。,1.3 TOLL樣受體及NOD樣受體,NOD樣受體(NLR) 和TOLL樣受體（TLR）均屬于模式識別受體(PRR)，TLR分布在細(xì)胞表面和特異的細(xì)胞器，主要識別的是胞外微生物，其在識別細(xì)胞表面的致敏原進(jìn)而在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，某些微生物逃避細(xì)胞膜PRR進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，則由NLR進(jìn)行識別，NLR是存在于細(xì)胞漿內(nèi)的一組蛋白家族，能夠介導(dǎo)由細(xì)

13、胞內(nèi)致病原及內(nèi)源危險(xiǎn)信號所引發(fā)的保護(hù)性免疫反應(yīng).,1.3.1 NOD樣受體信號通路中各差異表達(dá)因子及對應(yīng)RPKM值,,表4 NOD樣受體信號通路中各差異表達(dá)因子及對應(yīng)RPKM值,,NOD樣受體信號通路中各細(xì)胞因子差異表達(dá)情況的理解,本次實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測結(jié)果提示，與正常對照組比較，AR患者鼻甲組織中CCL2的mRNA表達(dá)量顯著增加。參照KEGG數(shù)據(jù)庫顯示CCL2參與的NOD樣受體信號通路，同時伴有TH2類細(xì)胞因子IL-6表達(dá)上

14、調(diào)，其中一例實(shí)驗(yàn)組顯示JUK及Th1類細(xì)胞因子IL-8表達(dá)下調(diào)，我們推測，CCL2參與AR的發(fā)病過程，可能在NOD樣受體信號通路中起某種作用。,,結(jié)論,CCL2在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜中表達(dá)增強(qiáng)，可能是變應(yīng)性鼻炎發(fā)病及向鼻息肉增生轉(zhuǎn)變的主要因素。,說明,我們也注意到，對于在同類研究中多次報(bào)道的嗜酸粒細(xì)胞的特異性趨化因子Eotaxin及另一種對嗜酸粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞都有趨化作用的趨化因子Rantes (CCL5)在本次試驗(yàn)過程并未出現(xiàn)陽性結(jié)