趨化因子CCL2和長(zhǎng)鏈非編碼RNA AVAN抗流感病毒作用機(jī)制研究.pdf

1、流感是危害人類健康的重要呼吸道傳染病，曾多次引起全球暴發(fā)流行，奪走數(shù)千萬(wàn)人生命。流感病毒感染容易造成急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終導(dǎo)致死亡。研究表明，急性肺損傷的產(chǎn)生，一方面是由于病毒本身，另一方面是由于感染引起的過(guò)度免疫反應(yīng)導(dǎo)致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”（cytokine storm）。隨著研究的

2、深入，許多和流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷密切相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子被發(fā)現(xiàn)，但其功能一直存在爭(zhēng)議，并且在禽流感病毒感染中報(bào)道甚少，特別是H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷，至今未見(jiàn)報(bào)道。
　　隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，其在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、個(gè)體發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)等。在抗病毒天然免疫反應(yīng)過(guò)程中，雖也有少數(shù)有功能的

3、lncRNA被發(fā)現(xiàn)，但仍存在著大量功能未知的lncRNA，特別是中性粒細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜，至今未見(jiàn)報(bào)道。我們?cè)O(shè)想找到一條lncRNA，可在抗病毒天然免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。
　　基于以上研究背景，我們擬從趨化因子和長(zhǎng)鏈非編碼RNA功能和機(jī)制為切入點(diǎn)，分別從蛋白水平和RNA水平，探討天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒感染導(dǎo)致的急性肺損傷中的作用，開(kāi)展以下兩部分研究：
　　一、趨化因子CCL2在甲型 H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急

4、性肺損傷中的作用研究
　　為了建立甲型H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷的小鼠模型，我們首先利用H7N9禽流感毒株（Ah01株和Hb01株）感染C57BL/6小鼠，從小鼠體重變化和死亡率結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)感染效果，結(jié)果顯示Hb01株毒力較Ah01株強(qiáng)，能夠使小鼠體重顯著下降，并快速誘導(dǎo)小鼠死亡。我們進(jìn)一步分析了小鼠肺部病理改變和肺部水腫程度，發(fā)現(xiàn)Hb01株H7N9禽流感病毒能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肺損傷，因此我們選擇 Hb01株 H7N9

5、禽流感病毒感染小鼠模型為后續(xù)研究模型。在建模過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)H7N9感染后小鼠的死亡高峰基本在一周出現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的H5N1感染后小鼠死亡情況相似，這提示天然免疫同樣在H7N9感染導(dǎo)致小鼠死亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。利用獲得性免疫缺陷小鼠（Rag1-/-小鼠）感染H7N9模型，結(jié)果顯示Rag1-/-小鼠感染H7N9后表現(xiàn)出和野生型幾乎相同的死亡率、體重變化以及肺部病理變化，這進(jìn)一步表明H7N9感染導(dǎo)致小鼠主要在天然免疫階段。
　　

6、為了研究H7N9感染后小鼠的高細(xì)胞因子血癥，我們收集了H7N9感染后第5天小鼠的血清和支氣管肺泡灌洗液，進(jìn)行細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示大部分炎性細(xì)胞因子和趨化因子在感染后都有一定程度的升高，其中單核/巨噬細(xì)胞最重要的趨化因子CCL2在小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中都明顯升高，且維持在較高水平?？紤]到CCL2的作用及其表達(dá)水平，提示CCL2可能在H7N9感染導(dǎo)致的急性肺損傷中起到關(guān)鍵的作用。
　　我們進(jìn)一步檢測(cè)了H7N9感

7、染后小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中CCL2的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示小鼠感染H7N9后，CCL2從第1天開(kāi)始便出現(xiàn)明顯的上升，其中在支氣管肺泡灌洗液中，CCL2的表達(dá)于第7天達(dá)峰，第9天開(kāi)始回落；而在血清中一直呈高表達(dá)水平。通過(guò)共聚焦實(shí)驗(yàn)，我們也發(fā)現(xiàn)H7N9感染的小鼠肺組織中有大量的CCL2表達(dá)，進(jìn)一步提示了CCL2具有重要的作用。
　　最后，為了明確CCL2在H7N9感染介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，我們通過(guò)CCL2基因敲除小鼠感染H7N9

8、發(fā)現(xiàn)，CCL2基因敲除后，小鼠的死亡率明顯降低，體重下降減緩，且小鼠肺水腫情況明顯改善，肺損傷得到緩解。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后，支氣管肺泡中的中性粒細(xì)胞募集顯著增加，相反的，單核/巨噬細(xì)胞的募集卻被抑制了。病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)顯示CCL2基因敲除后不能影響H7N9在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。
　　綜上所述，我們首次建立了H7N9感染小鼠致死模型，分析獲得了小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)譜，明確了CCL2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，

9、且發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可有效緩解H7N9感染導(dǎo)致的急性肺損傷。我們?cè)谶M(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可抑制支氣管肺泡中單核/巨噬細(xì)胞的募集，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞募集。這些結(jié)果提示我們中性粒細(xì)胞在H7N9感染介導(dǎo)的急性肺損傷過(guò)程中可能起到關(guān)鍵作用，啟發(fā)了我們的下一部分工作，同時(shí)也為趨化因子在H7N9禽流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷過(guò)程中的研究提供了依據(jù)。
　　二、長(zhǎng)鏈非編碼RNA AVAN在天然免疫抗流感病毒中的作用機(jī)制研究
　　為

10、了研究lncRNA在天然免疫抗流感病毒中的作用，我們首先利用二代測(cè)序檢測(cè)了流感病毒感染患者危急重期與其恢復(fù)期的外周血中性粒細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了全新的差異表達(dá)的lncRNA共有433條；經(jīng)過(guò)篩選進(jìn)一步確定了一條全新的lncRNA在病毒感染后顯著高表達(dá)，我們將其命名為AVAN(anti-virusand activate neutrophils，AVAN)。我們又利用NB和RACE實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AVAN只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為517核

11、苷酸，通過(guò)核質(zhì)分離和RNA-FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AVAN均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。通過(guò)檢測(cè) AVAN在病毒感染后的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)具有一定的劑量依賴和時(shí)間依賴。
　　在此基礎(chǔ)上，我們又開(kāi)展了AVAN功能研究。首先分析了測(cè)序結(jié)果中和AVAN表達(dá)相關(guān)的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些mRNA主要和流感病毒復(fù)制以及天然免疫激活相關(guān)。功能獲得和缺失實(shí)驗(yàn)表明AVAN能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)，抑制流感病毒復(fù)制；同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn) AVAN能夠有效地激活中性粒細(xì)

12、胞，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化性。
　　為了探究AVAN發(fā)揮抗病毒和增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性的具體分子機(jī)制，我們首先利用RNA pull down技術(shù)，對(duì)差異富集的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)AVAN相對(duì)于其反義對(duì)照序列能夠有效地富集E3泛素連接酶TRIM25；用免疫印跡和RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證AVAN和TRIM25確有直接相互作用。同時(shí)，利用IP等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AVAN可增強(qiáng)TRIM25與RIG-I相互作用，促進(jìn)RIG-I的泛素化，從而激活了RIG-I信

13、號(hào)通路，誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)，抑制流感病毒復(fù)制。
　　考慮到AVAN同TRIM25相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)，而AVAN在細(xì)胞核內(nèi)也有大量分布。根據(jù)lncRNA的作用方式，我們推測(cè)AVAN可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾，進(jìn)而影響其他基因的表達(dá)發(fā)揮功能?；蚪M定位分析可見(jiàn)，AVAN位于6號(hào)染色體，在轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)的反義鏈上。我們構(gòu)建了FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)的雙螢光素酶報(bào)告載體，發(fā)現(xiàn)AVAN能夠增強(qiáng)其螢光素酶活性，我們進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平

14、和蛋白水平都驗(yàn)證了AVAN能夠明顯地促進(jìn)FOXO3a的表達(dá)。為了明確AVAN是否能夠與FOXO3a的啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合，我們利用ChIRP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AVAN能夠直接結(jié)合到FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)（-600到-1000nt區(qū)域）。利用ChIP實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)AVAN能夠影響FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)（-600到-1000nt區(qū)域）H3K4me3和H3K27ac兩種組蛋白修飾，以及該區(qū)域RNA聚合酶II的結(jié)合。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVAN能夠通過(guò)反式作用方式

15、來(lái)促進(jìn)FOXO3a的表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步全面地了解AVAN對(duì)病毒感染后轉(zhuǎn)錄組的變化，我們用流感病毒感染AVAN過(guò)表達(dá)的細(xì)胞，利用mRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AVAN上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在I型干擾素通路以及細(xì)胞因子分泌通路。這進(jìn)一步證實(shí)了我們前面所發(fā)現(xiàn)的AVAN能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)和中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果。
　　最后，我們利用腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體在C57BL/6小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)AV

16、AN，然后利用流感病毒感染小鼠，分別從體重變化、死亡率、肺臟的病理改變、水腫程度以及病毒滴度等方面觀察AVAN在小鼠體內(nèi)的作用。我們發(fā)現(xiàn)AVAN過(guò)表達(dá)后，流感病毒介導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的程度明顯得到了緩解，而且肺臟中病毒滴度也有明顯的下降。這證明在流感病毒感染時(shí)，AVAN能夠有效地保護(hù)小鼠。
　　綜上所述，我們首次獲得了流感病人外周血中性粒細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜；篩選獲得了一條全新的lncRNA AVAN，并對(duì)其做了全面的注釋和認(rèn)識(shí)

17、。通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AVAN能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)而抑制流感病毒復(fù)制，同時(shí)AVAN還能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞激活，增強(qiáng)其趨化性。在分子機(jī)制上，AVAN能夠在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)與TRIM25相互作用，影響RIG-I信號(hào)通路的激活；在細(xì)胞核中，AVAN能夠通過(guò)反式作用方式促進(jìn)FOXO3a的表達(dá)，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的活性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)AVAN能夠有效緩解流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷。此研究為將來(lái)篩選新型抗流感病毒RNA藥物提供了依據(jù)。
　　總之，

18、通過(guò)以上兩部分實(shí)驗(yàn)，研究了天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，探索了lncRNA在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)的作用及機(jī)制，建立了一整套天然免疫抗病毒研究體系，為今后進(jìn)一步研究其他呼吸道病毒及新發(fā)突發(fā)傳染病奠定了基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL2是甲型H7N9禽流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷的重要因素，同時(shí)也鑒定出一條全新的lncRNA AVAN在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，為將來(lái)篩選新型抗病毒藥物提供了理論依據(jù)