長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC728228作用機(jī)制的探索.pdf

1、背景與目的：
　　肺癌是世界常見的惡性腫瘤之一。近年來，許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率明顯增加。據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織研究表明：全球男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性肺癌發(fā)病率占第四位，死亡率占第二位。雖然目前肺癌診斷和治療已取得了很大的進(jìn)步，但其5年生存率仍然很低。多年來的研究表明，肺癌發(fā)病是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜病變過程，先是產(chǎn)生組織學(xué)上可以辨認(rèn)的癌前病變，最后導(dǎo)致侵襲性腫瘤產(chǎn)生。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子

2、生物學(xué)研究表明，多個(gè)癌基因、抑癌基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程起決定性作用，如ras家族、myc家族、EGFR、c-erbB-2、Bcl-2、c-fos等癌基因，他們的突變或擴(kuò)增會(huì)促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，導(dǎo)致肺癌發(fā)生，而p16、RB、p53等抑癌基因，其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，但在肺癌中，他們通常因突變而失活或因基因丟失而失去表達(dá)，同樣促進(jìn)了肺癌的發(fā)生。
　　人類基因組計(jì)劃完成了人類基因組近30億個(gè)核苷酸堿基的序列測(cè)定，確定了約3萬個(gè)蛋白編碼基因

3、，發(fā)現(xiàn)蛋白編碼基因只占基因組的約2％。大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，人類基因組大多區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄活性，除蛋白編碼基因外，剩下的區(qū)域也可發(fā)生轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大多為非編碼RNA。這些非編碼RNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。近年來，越來越多的研究表明，非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞和生物體的各個(gè)調(diào)控途徑中發(fā)揮著重要作用，不斷有研究發(fā)現(xiàn)具有重要生物學(xué)功能的非編碼RNA。這些非編碼RNA可分為miRNA、piRNA、snoRNA和長(zhǎng)鏈非編

4、碼RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）等。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA，是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸，但不具有蛋白編碼能力的RNA。它們是非編碼RNA中最大的一類。隨著一些lncRNA的重要功能的闡釋，對(duì)lncRNA的研究也得到了人們的重視。近幾年大量的研究表明lncRNA具有廣泛的生物學(xué)作用，它可在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)部分lncRNA與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一

5、些lncRNA的表達(dá)具有腫瘤特異性，可作為腫瘤診斷和治療新的分子標(biāo)志物，如lncRNAPCA3在前列腺癌中高度過表達(dá)，可作為前列腺癌高度特異的核酸分子標(biāo)志物，其特異性高于血清前列腺癌特異性抗原(PSA)，現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)成臨床的商業(yè)化試劑盒；還有一些lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，被認(rèn)為癌基因或抑癌基因，如H19、HOTAIR、PCGEM1等。也有不少肺癌相關(guān)的lncRNA與的報(bào)道，如MALAT1、MEG3、SCAL

6、1等也與肺癌相關(guān)。目前l(fā)ncRNA相關(guān)研究較多，但大部分的lncRNA功能仍然未知，其作用機(jī)制的相關(guān)研究則更為稀少，僅少數(shù)lncRNA的機(jī)制得到了一定程度的闡釋，因此尋找具有重要功能的lncRNA并探索它們的作用機(jī)制非常重要，尤其是尋找與腫瘤相關(guān)的lncRNA，可極大地促進(jìn)人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)。在本課題研究中，我們尋找與肺癌相關(guān)的lncRNA，并進(jìn)一步探索它們的功能和可能的作用機(jī)制。
　　之前我們實(shí)驗(yàn)室的一些研究結(jié)果表明，ln

7、cRNALOC728228在肺癌16HBE-T和A549細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)LOC728228的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制，且細(xì)胞出現(xiàn)周期G0/G1期阻滯，但細(xì)胞凋亡并不受影響。穩(wěn)定下調(diào)LOC728228的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞克隆形成能力減弱，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱，且在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，LOC728228表達(dá)下調(diào)的腫瘤細(xì)胞形成的腫瘤體積較小，生長(zhǎng)較慢等，說明LOC728228在肺癌細(xì)胞中具有類似于癌基因的功能。
　　本文針對(duì)LOC72822

8、8的以上功能，探索它可能的作用機(jī)制。結(jié)果表明LOC728228不具有順式作用功能，且其RNA主要分布于細(xì)胞漿，說明它可能在細(xì)胞漿中發(fā)揮作用。由于它的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，因此檢測(cè)了周期相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LOC728228下調(diào)后，cyclinD1下調(diào)明顯，而下調(diào)cyclinD1確實(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞周期G0/G1期阻滯。說明LOC728228可能是通過調(diào)節(jié)cyclinD1來發(fā)揮作用的，但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。
　　方法：

9、
　　1.定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)siLOC728228-2轉(zhuǎn)染16HBE-T細(xì)胞，用SYBRGreen染料法對(duì)LOC728228鄰近基因進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)。
　　2.LOC728228胞漿胞核分布按AmbionPariskit試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別提取16HBE-T細(xì)胞核和細(xì)胞漿RNA，并用qRT-PCR檢測(cè)LOC728228在胞漿、胞核中的相對(duì)表達(dá)。
　　3.siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用Lipofectam

10、ine-2000將siRNA按說明書的轉(zhuǎn)染步驟導(dǎo)入16HBE-T細(xì)胞，用qRT-PCR定量檢測(cè)siRNA敲除效果，并確定其有效序列和最佳轉(zhuǎn)染濃度。
　　4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)96孔板每孔接種3×103個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后轉(zhuǎn)染siRNA，分別于轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。
　　5.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)6孔板種板，每孔10萬個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，70%酒精固定過夜，PI染色，

11、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　6.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均至少3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以x?s表示。兩組間比較雙側(cè)t檢驗(yàn)，3組以上的比較采用單因素方差分析，所有檢驗(yàn)均以雙側(cè)P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.下調(diào)LOC728228后，其鄰近基因的表達(dá)變化用siLOC728228-2干擾序列轉(zhuǎn)染16HBE-T細(xì)胞，處理48小時(shí)后，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LOC728228的表達(dá)下

12、調(diào)明顯，其大部分鄰近基因的表達(dá)與對(duì)照組相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，部分基因表達(dá)出現(xiàn)改變，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05），但差異均小于2倍。
　　2.LOC728228基因的胞漿胞核分布qRT-PCR檢測(cè)目的基因和多個(gè)內(nèi)參基因，結(jié)果表明，內(nèi)參基因的胞漿胞核比均與實(shí)際情況相符，目的基因LOC728228第一對(duì)引物檢測(cè)的胞漿胞核比為3.00±0.81，第二對(duì)引物檢測(cè)的比值為3.13±0.94。
　　3.用siRNA敲除目的基

13、因后的表達(dá)變化分別用3個(gè)siCCND1序列轉(zhuǎn)染處理16HBE-T細(xì)胞48h后，qRT-PCR檢測(cè)cyclinD1的表達(dá)，結(jié)果表明siCCND1-1和siCCND1-3在16HBE-T細(xì)胞中抑制cyclinD1的效果較好，與16HBE-T和NC組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。siCCND1-1的最佳使用濃度為30nmol/l，siCCND1-3的最佳使用濃度為50nmol/l，兩者干擾效率都達(dá)到85%以上，與16HBE-T和NC相

14、比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力改變用siCCND1-1和siCCND1-3分別轉(zhuǎn)染16HBE-T細(xì)胞，48h、72h細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯下降，與空白對(duì)照組和NC相相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。48h細(xì)胞活力分別為（0.29±0.02）和（0.28±0.03），72h細(xì)胞活力分別為（0.43±0.05）和（0.39±0.01）。
　　5.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期改變分別用siCCND1-1和siC

15、CND1-3轉(zhuǎn)染處理16HBE-T細(xì)胞48h后，與空白對(duì)照組和NC組相比，轉(zhuǎn)染siCCND1組細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。細(xì)胞G0/G1期分別由69.64%上升至79.35%、82.61%，而S期分別由27.22%下降至16.96%、14.88%，與空白對(duì)照組和NC組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．lncRNALOC728228不具有順式作用功能。
　　2．lncRNALOC728228的轉(zhuǎn)