長(zhǎng)鏈非編碼RNA在急性放射性肺損傷中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:采用高通量長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs,LncRNAs)芯片篩選可能與放射性肺損傷相關(guān)的lncRNAs,初步在體外探討lncRNA對(duì)放射性肺損傷發(fā)生的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:(1)5~6周齡雌性C57BL/6小鼠共24只,分為照射組和對(duì)照組,每組12只。經(jīng)12Gy6-MeV X射線直線加速器進(jìn)行全胸照射,劑量率200cGy/min,源皮距100cm。照射后24 h取右半肺經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后

2、進(jìn)行免疫組化檢測(cè)磷酸化γ-H2AX表達(dá)。左半肺則經(jīng)RNA提取、純化、標(biāo)記后進(jìn)行小鼠LncRNA基因芯片檢測(cè)。雜交信號(hào)經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得放射性肺損傷早期差異表達(dá)的lncRNAs。相關(guān)lncRNAs最后經(jīng)Realtime PCR進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(2)選取經(jīng)驗(yàn)證和分析后的一種lncRNA,設(shè)計(jì)合成相應(yīng)siRNA干擾細(xì)胞中該lncRNA的轉(zhuǎn)錄。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA敲減對(duì)肺上皮細(xì)胞Beas-2B細(xì)胞增殖能力的影

3、響,通過流式細(xì)胞術(shù)分析lncRNA轉(zhuǎn)錄抑制對(duì)Beas-2B細(xì)胞周期分布及凋亡的影響。經(jīng)磷酸化γ-H2AX免疫熒光染色法檢測(cè)抑制該 lncRNA對(duì)Beas-2B細(xì)胞中由電離輻射引起的DNA損傷情況。通過Western blot法初步確定抑制該lncRNA對(duì)肺上皮細(xì)胞電離輻射后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　　結(jié)果:(1)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)照射組小鼠肺組織中磷酸化γ-H2AX表達(dá)顯著增加(P<0.05)。經(jīng)基因芯

4、片篩選出放射性肺損傷早期304種差異表達(dá)的lncRNAs,其中62種表達(dá)上調(diào),242種表達(dá)下調(diào);有9種差異表達(dá)的lncRNAs位于編碼基因附近(<300bp)。同時(shí)篩選出了97種高表達(dá)和463種低表達(dá)的mRNA,GO分析這些 mRNA主要集中在應(yīng)激反應(yīng),免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)通路,pathway分析發(fā)現(xiàn)參與P53信號(hào)、新陳代謝等信號(hào)調(diào)節(jié)通路。最后在放射性肺損傷早期肺組織中經(jīng)Realtime PCR驗(yàn)證了位于編碼基因附近的6種差異表達(dá)lncRNA

5、s。經(jīng)生物信息學(xué)分析,選取其中1種受照后顯著上調(diào)的lncRNA進(jìn)行后續(xù)功能研究。(2)成功構(gòu)建lncRNA低表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞穩(wěn)定株。lncRNA低表達(dá)可顯著增加Beas-2B細(xì)胞的增殖速率,并引起B(yǎng)eas-2B細(xì)胞發(fā)生明顯的G2期阻滯。減少電離輻射引起的γ-H2AX foci的數(shù)目。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA低表達(dá)后Beas-2B細(xì)胞中周期相關(guān)RAD50、磷酸化P53和RB蛋白表達(dá)水平明顯減少,而KU70、KU