長鏈非編碼RNA在急性放射性肺損傷中的作用及機制的初步研究.pdf

1、目的:采用高通量長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs,LncRNAs)芯片篩選可能與放射性肺損傷相關的lncRNAs,初步在體外探討lncRNA對放射性肺損傷發(fā)生的影響及相關機制。
　　方法:(1)5~6周齡雌性C57BL/6小鼠共24只,分為照射組和對照組,每組12只。經12Gy6-MeV X射線直線加速器進行全胸照射,劑量率200cGy/min,源皮距100cm。照射后24 h取右半肺經甲醛固定、石蠟包埋后

2、進行免疫組化檢測磷酸化γ-H2AX表達。左半肺則經RNA提取、純化、標記后進行小鼠LncRNA基因芯片檢測。雜交信號經生物信息學分析獲得放射性肺損傷早期差異表達的lncRNAs。相關lncRNAs最后經Realtime PCR進行驗證,并進一步進行生物信息學分析。(2)選取經驗證和分析后的一種lncRNA,設計合成相應siRNA干擾細胞中該lncRNA的轉錄。采用克隆形成實驗檢測lncRNA敲減對肺上皮細胞Beas-2B細胞增殖能力的影

3、響,通過流式細胞術分析lncRNA轉錄抑制對Beas-2B細胞周期分布及凋亡的影響。經磷酸化γ-H2AX免疫熒光染色法檢測抑制該 lncRNA對Beas-2B細胞中由電離輻射引起的DNA損傷情況。通過Western blot法初步確定抑制該lncRNA對肺上皮細胞電離輻射后細胞周期相關蛋白及DNA損傷修復相關蛋白表達的調控。
　　結果:(1)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)照射組小鼠肺組織中磷酸化γ-H2AX表達顯著增加(P<0.05)。經基因芯

4、片篩選出放射性肺損傷早期304種差異表達的lncRNAs,其中62種表達上調,242種表達下調;有9種差異表達的lncRNAs位于編碼基因附近(<300bp)。同時篩選出了97種高表達和463種低表達的mRNA,GO分析這些 mRNA主要集中在應激反應,免疫調節(jié)等相關通路,pathway分析發(fā)現(xiàn)參與P53信號、新陳代謝等信號調節(jié)通路。最后在放射性肺損傷早期肺組織中經Realtime PCR驗證了位于編碼基因附近的6種差異表達lncRNA

5、s。經生物信息學分析,選取其中1種受照后顯著上調的lncRNA進行后續(xù)功能研究。(2)成功構建lncRNA低表達的Beas-2B細胞穩(wěn)定株。lncRNA低表達可顯著增加Beas-2B細胞的增殖速率,并引起B(yǎng)eas-2B細胞發(fā)生明顯的G2期阻滯。減少電離輻射引起的γ-H2AX foci的數(shù)目。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA低表達后Beas-2B細胞中周期相關RAD50、磷酸化P53和RB蛋白表達水平明顯減少,而KU70、KU