長鏈非編碼RNA調控小鼠卵巢發(fā)育的初步研究.pdf

1、卵巢是雌性動物生殖系統(tǒng)中重要的器官之一，它的功能主要分為兩大方面，一是作為卵母細胞發(fā)育成熟的場所，分化出具有受精能力的卵母細胞；二是卵巢分泌的性腺激素調控卵泡發(fā)育和生殖周期等。卵巢活動的周期性由多種因素調節(jié)，如促性腺激素、細胞因子及核酸分子。長鏈非編碼RNA(lncRNA)能在表觀遺傳調控，轉錄調控及轉錄后調控等層面上調控基因的表達水平，已報道有很多l(xiāng)ncRNA參與了生物個體的發(fā)育和疾病的發(fā)生，成為基因研究的重點領域。卵巢是雌性動物機體

2、生理變化最活躍的器官之一，但目前l(fā)ncRNA參與調控卵巢發(fā)育的研究鮮有報道。為了研究lncRNA在卵巢生殖活動中的功能，本論文設計了四個連續(xù)實驗，具體的實驗設計、研究內容和實驗結果如下。
　　實驗一：探討卵巢中特異性表達的lncRNA。首先，分析實驗室的lncRNA基因庫，從中篩選出16個基因，通過實時熒光定量PCR（qPCR）檢測證實有9個lncRNA在小鼠多種組織中相對高表達，并發(fā)現(xiàn)lncRNA647、lncRNA147和ln

3、cRNA274在卵巢組織中相對特異性高表達。
　　實驗二：不同卵巢狀態(tài)下lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274基因的表達豐度。分別檢測了這3個基因在小鼠不同發(fā)育時期（5日齡、3周齡、5周齡、8周齡）和發(fā)情周期不同發(fā)情時期（發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期）卵巢中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)lncRNA147和 lncRNA274在8周齡小鼠卵巢中的表達水平最高，在其它3個發(fā)育階段卵巢中的表達水平從高到低依次為5日齡

4、卵巢，5周齡卵巢和3周齡卵巢；lncRNA647在5周齡和8周齡卵巢中的表達水平最高，在其它2個發(fā)育時期卵巢中的表達水平從高到低依次為5天齡卵巢和3周齡卵巢。在發(fā)情周期不同發(fā)情時期的卵巢中，3個lncRNA的表達水平均按照發(fā)情間期、發(fā)情前期，發(fā)情期和發(fā)情后期依次升高，其中在發(fā)情后期中的表達水平顯著高于其它三個發(fā)情時期。
　　實驗三：研究這3個lncRNA基因在卵巢中特異表達后對卵巢功能的影響。構建ZP3基因啟動子-目的lncRNA

5、基因過表達質粒載體；利用體內轉染的方法，在8周齡雌鼠右側卵巢中分別注射lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274載體，左側卵巢注射ZP3骨架載體（不含目的基因）。轉染72小時后摘取兩側卵巢，分別提取卵巢組織總RNA并反轉錄為cDNA，檢測目的基因和卵泡發(fā)育相關基因的表達水平，以及卵巢組織制作石蠟切片并HE染色，觀察并統(tǒng)計腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中過表達lncRNA274后，與對照組相比卵泡發(fā)育相

6、關基因FSHR的表達水平升高了約7倍，LHR升高了約18倍，GDF-9升高了約11倍，BMP-15升高了約7.5倍，EGFR升高了約7.5倍；黃體的數(shù)量（13.3±4.9）與對照組（4.3±0.6）相比顯著增加，而腔前卵泡、有腔卵泡數(shù)量無顯著差異。過表達lncRNA147后，與對照組相比FSHR、GDF-9、BMP-15的表達水平無顯著差異，LHR升高了約4倍，EGFR升高了約5倍；腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。

7、過表達lncRNA647后，F(xiàn)SHR、LHR、GDF-9，BMP-15和EGFR的表達水平與對照組相比均無顯著差異；腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。
　　實驗四：進一步驗證lncRNA274對小鼠排卵的作用。構建了lncRNA274轉基因小鼠。通過小鼠1細胞胚胎階段制作lncRNA274轉基因小鼠，分別獲得F0代和F1代的轉基因小鼠和同窩野生型小鼠，并對其生育能力進行統(tǒng)計，結果發(fā)現(xiàn)10＃-F0代轉基因雌鼠產(chǎn)仔

8、數(shù)（10.5±0.6）較同窩野生型小鼠（7.75±1.7）有顯著差異，1＃-F1代和10＃-F1代轉基因雌鼠產(chǎn)仔數(shù)（11±1.4，10±1.4）較同窩野生型小鼠（7.5±0.7，6.5±0.7）也均有顯著差異。F0代和F1代轉基因小鼠子代與野生型小鼠子代的體重與體長無明顯差異。
　　綜合上述實驗結果，發(fā)現(xiàn)3個在小鼠卵巢中相對特異性高表達的lncRNA(lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274)，且它們在8周齡和發(fā)