長非編碼RNA Gtl2在小鼠胚胎發(fā)育早期的表達(dá)調(diào)控及功能研究.pdf

1、長非編碼RNA（lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA分子，廣泛參與多種重要的生物學(xué)過程。最近的研究表明，Dlk1-Dio3印記基因簇內(nèi)非編碼RNA（ncRNAs）的活化程度與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的發(fā)育潛能呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示此區(qū)間lncRNA Gtl2的表達(dá)起始于8細(xì)胞時(shí)期，同時(shí)該區(qū)間內(nèi)重要差異甲基化區(qū)IG-DMR和Gtl2-DMR的甲基化模式在早期胚胎各階段并未發(fā)生變化，推測DNA甲基化不是Gtl2表達(dá)調(diào)控的主要因素

2、。本研究以小鼠Dlk1-Dio3印記區(qū)間內(nèi)最重要的lncRNA Gtl2為研究對象，進(jìn)一步揭示其在早期胚胎中的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而對其在早期胚胎中的功能展開研究。
　　本課題首先明確Gtl2在早期胚胎中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及亞細(xì)胞定位。通過RNA FISH對其在桑椹胚、早期囊胚和囊胚中的定位研究顯示，Gtl2在桑椹胚期均勻分布，隨著向囊胚的發(fā)育，其表達(dá)逐漸向內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）細(xì)胞聚集；而到囊胚時(shí)期，其表達(dá)幾乎完全集中于ICM細(xì)胞，滋

3、養(yǎng)層細(xì)胞（TE）細(xì)胞中幾乎檢測不到表達(dá)信號。在這一發(fā)育過程中Gtl2始終主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。印記分析顯示，Gtl2在初始表達(dá)的桑椹胚時(shí)期即為父本印記母本表達(dá)。
　　由于Dlk1-Dio3印記簇印記控制區(qū)的DNA甲基化模式無法解釋Gtl2的表達(dá)調(diào)控，本研究檢測了Gtl2表達(dá)前后重要位點(diǎn)組蛋白修飾的情況。利用微量樣品染色質(zhì)免疫共沉淀(μChIP)方法，對IG-DMR區(qū)和Gtl2啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾檢測發(fā)現(xiàn)，在Gtl2不表達(dá)的8-細(xì)胞期

4、，這兩個(gè)區(qū)域都存在明顯的抑制性組蛋白修飾H3K9me3，而激活性組蛋白修飾H3K4me3較弱；隨著胚胎逐步發(fā)育到桑椹胚和囊胚期，這兩區(qū)域的激活性組蛋白修飾H3K4me3顯著增強(qiáng)，而抑制性組蛋白修飾H3K9me3顯著減弱。結(jié)果提示Gtl2在早期胚胎中表達(dá)的啟動(dòng)可能受到激活性組蛋白修飾 H3K4me3和抑制性組蛋白修飾H3K9me3的協(xié)同調(diào)控。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了靶向Oct4、Sox2和Nanog慢病毒RNA干擾載體，通過透明帶下注射法在早期

5、胚胎發(fā)育過程中分別干擾了Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2和Nanog干擾后Gtl2的表達(dá)也相應(yīng)發(fā)生了下調(diào)，表明干細(xì)胞多能性因子Oct4、Sox2和Nanog對Gtl2表達(dá)的調(diào)控具有調(diào)控作用。
　　鑒于Gtl2在胚胎早期發(fā)育過程中獨(dú)特的時(shí)空表達(dá)模式，本研究對其在早期胚胎中的功能進(jìn)行了初步探索。通過構(gòu)建Gtl2的慢病毒RNA干擾載體結(jié)合透明帶下注射法在早期胚胎中干擾Gtl2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gtl2干擾后

6、雖然不影響囊胚的發(fā)育率，但卻顯著影響囊胚后期的發(fā)育能力。定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Gtl2干擾后同簇基因、干細(xì)胞多能性因子和分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)都出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，提示Gtl2在早期胚胎發(fā)育過程中參與了廣泛的基因表達(dá)調(diào)控。
　　綜上所述，lncRNA Gtl2在早期胚胎發(fā)育過程中具有獨(dú)特的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位，其表達(dá)受到組蛋白修飾的調(diào)控和干細(xì)胞多能性因子的調(diào)控。同時(shí)其在早期胚胎中的表達(dá)對于胚胎的發(fā)育具有潛在的重要作用，這些結(jié)