山羊早期胚胎發(fā)育基因表達的研究.pdf

1、為了解山羊早期胚胎發(fā)育基因表達的分子機制，建立不同發(fā)育階段基因表達的模式，探討體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育阻滯形成的分子機理，進行了三個方面的研究：1.單個冷凍胚胎銀染mRNA差異顯示方法建立的研究用昆明種小白鼠作為實驗材料，通過超數(shù)排卵處理后獲得小鼠早期發(fā)育的4細胞和8細胞期胚胎。通過單個鮮胚和冷凍胚胎的RT-PCR反應產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜及持家基因的擴增檢測，表明凍胚和鮮胚具有相同的實驗結(jié)果。用銀染法取代同位素法，可以顯示特異表達的條帶，并避免了

2、放射性污染。用一步法和煮沸法取代乙醇糖原法回收特異條帶，操作簡便，程序簡化，經(jīng)過二次擴增、回收、差異條帶的亞克隆、提取質(zhì)粒及酶切鑒定等環(huán)節(jié)，證明回收方法有效。用所建立的差顯方法獲得了一條在小鼠8細胞期胚胎特異表達的片段，經(jīng)過測序及比對分析，表明與鼠2號染色體上RP23-20A6mRNA克隆具有100﹪同源性。 結(jié)果表明：單個冷凍胚胎銀染mRNA差異顯示方法有效、實用、可靠，可用于動物早期胚胎發(fā)育基因表達的研究。 2.體外

3、培養(yǎng)的山羊早期胚胎發(fā)育基因表達的研究通過卵母細胞的體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)方法，獲取山羊早期發(fā)育的2細胞、4細胞和8～16細胞期胚胎。通過單個冷凍胚胎銀染mRNA差異顯示方法，共篩選到16條在不同時期胚胎特異表達的片段，其中2細胞期5條帶，4細胞期4條帶，8～16細胞期7條帶。經(jīng)過測序及比對分析，表明有4條帶與已知的功能基因或調(diào)控基因相似，5條帶為未知功能基因，7條帶無相似基因。其中：A21條帶在2細胞期胚胎特異表達，相似于人類肽基

4、精氨酸脫亞胺酶(PAD)基因(83﹪)； B43條帶在4細胞期胚胎特異表達，相似于牛胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)基因(88﹪)； A86條帶在8～16細胞期胚胎特異表達，相似于牛NADH脫氫酶1α亞復合體4(NDUFA4)基因(97﹪)； B83條帶在8～16細胞期胚胎特異表達，相似于犬細胞周期蛋白B3(CCNB3)基因(82﹪)。 PAD通過對組蛋白和細胞骨架蛋白翻譯后的修飾作用，對早期胚

5、胎發(fā)育過程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表達調(diào)控起到重要作用；IGFBP-3通過調(diào)控IGFs的生物學活性而影響早期附植前胚胎的生長發(fā)育，并具有促進細胞分裂和影響內(nèi)分泌等作用，可直接參與早期胚胎的生長發(fā)育過程；NDUFA4可以通過調(diào)控ATP的合成，提供細胞活躍代謝以及DNA去甲基化和核內(nèi)基因組再程序化時的能量需要；CCNB3影響正常細胞的分裂，對細胞的分裂活動具有重要的調(diào)控作用。 結(jié)果表明：用單個冷凍胚胎銀染mRNA差異顯示方法，可以篩選羊早期

6、胚胎不同發(fā)育階段特異表達的基因，建立不同發(fā)育階段基因表達的模式。 3.山羊體內(nèi)外特定發(fā)育階段胚胎基因差異表達的研究通過常規(guī)同期發(fā)情和超數(shù)排卵方法處理后，獲取山羊體內(nèi)發(fā)育的8～16細胞期胚胎，通過體外培養(yǎng)的方法，獲取山羊體外發(fā)育的8～16細胞期胚胎。用單個冷凍胚胎銀染mRNA差異顯示方法，共篩選到20條在體內(nèi)發(fā)育胚胎表達，而在體外培養(yǎng)胚胎不表達的特異片段。經(jīng)過測序及比對分析，表明有3條帶與已知的功能基因或調(diào)控基因相似，1條帶為未知

7、功能基因，其余16條帶無相似基因。其中：Bl條帶相似于犬信號肽酶復合體25亞基(SPC25)基因(92﹪)；B9條帶相似于牛肥胖(Obese)基因(86﹪)；C4條帶相似于人核糖體蛋白L31基因(91﹪)。 SPC蛋白切除前體蛋白的信號肽使之成為成熟的分泌蛋白，分泌蛋白影響和作用于早期胚胎發(fā)育的生理過程；Leptin作用于卵母細胞的成熟以及早期胚胎的分裂和分化，同時能調(diào)節(jié)母體的妊娠生理，影響生殖激素的分泌；人核糖體蛋白L31基因