單倍體胚胎干細(xì)胞在早期胚胎發(fā)育研究中的應(yīng)用.pdf

1、早期胚胎發(fā)育是一個(gè)精細(xì)而又嚴(yán)格的調(diào)控過(guò)程，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中涉及組蛋白修飾的變化、雌雄基因組互作，甲基化的調(diào)控與變化等。研究早期胚胎發(fā)育機(jī)制對(duì)發(fā)育生物學(xué)以及生殖生物學(xué)乃至再生醫(yī)學(xué)都具有深遠(yuǎn)的意義，因此早期胚胎發(fā)育一直都是人們研究的熱點(diǎn)。因?yàn)樵缙谂咛ゲ牧系奶厥庑裕虼巳藗儗?duì)于早期胚胎發(fā)育的研究是長(zhǎng)久以來(lái)的難點(diǎn)，缺乏一種良好的研究工具。
　　單倍體胚胎干細(xì)胞(haESCs)是近年來(lái)興起的一種新型的胚胎干細(xì)胞。其特點(diǎn)是只含有一套染色體

2、組，并且擁有正常胚胎干細(xì)胞的特性，具有體外無(wú)限增殖以及分化的能力。單倍體胚胎干細(xì)胞分為孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞和孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞，由于其單倍體來(lái)源的多樣性，因此其成為可以模擬單套雌雄基因組的良好細(xì)胞系。同時(shí)其多能性以及體外無(wú)限增殖的特點(diǎn)，為其在體外進(jìn)行基因操作提供了很多有利的條件，為基因功能研究提供了一種良好的工具。同時(shí)，單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立為研究動(dòng)物遺傳修飾以及改造提供了新的渠道。
　　從精子與卵母細(xì)胞結(jié)合形成受精卵，在整個(gè)

3、早期胚胎發(fā)育過(guò)程中雌雄基因組互作以及表觀修飾變化一直處于動(dòng)態(tài)變化之中。但對(duì)其基因組互作以及表觀修飾的研究由于早期胚胎操作的難度很高，缺乏有效的研究手段。單倍體胚胎干細(xì)胞為這種雌雄基因組互作提供了一種新的研究手段。
　　基因組印記的變化是整個(gè)生命過(guò)程中最重要的生物學(xué)現(xiàn)象之一。印記基因是個(gè)體發(fā)育的重要保證，對(duì)于印記基因的研究由于其材料的特殊性難于收集，也造成了印記基因的研究方式單一，且研究困難。單倍體胚胎干細(xì)胞便于基因操作，因此成為研

4、究印記基因的良好素材。
　　本研究通過(guò)孤雌激活的方法獲得孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞，同時(shí)利用精子克隆的辦法獲得孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞，隨后對(duì)孤雌和孤雄胚胎干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有正常的單倍體核型，同時(shí)也具有正常的胚胎干細(xì)胞的多能性特征。隨后我們利用孤雌和孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞作為工具進(jìn)行早期胚胎發(fā)育的研究。
　　首先，利用孤雌孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，進(jìn)行四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究早期胚胎囊胚期前雌雄基因組互作對(duì)動(dòng)物到期發(fā)育是否

5、必要。成功地獲得了孤雌與孤雄融合的胚胎干細(xì)胞細(xì)胞系。該細(xì)胞系具備正常二倍體核型，同時(shí)其具有體外分化成三胚層以及二倍體種系嵌合的能力，證明其具備正常的ES細(xì)胞的多能性。最后利用四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，獲得四倍體到期小鼠，該實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞多能性最高級(jí)別驗(yàn)證的黃金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)也證明了在囊胚期前，雌雄基因組互作對(duì)動(dòng)物到期發(fā)育不是必需的。
　　其次，發(fā)現(xiàn)孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞具有隨著細(xì)胞代次增高DNA甲基化修飾不斷降低的特性，尤其是其印記調(diào)控區(qū)也存在

6、這樣的現(xiàn)象，同時(shí)孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)注射小鼠由于印記異常等原因只能發(fā)育到E13.5天。孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞的這些特性為印記基因的功能性研究提供了一種良好的工具，通過(guò)對(duì)孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞不同印記區(qū)域進(jìn)行修飾，來(lái)進(jìn)行印記對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響。通過(guò)對(duì)IGDMR的印記DMR區(qū)域的同源打靶獲得了IGDMR區(qū)域基因沉默的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞，該細(xì)胞支持動(dòng)物到期發(fā)育，但影響其成活。隨后，在IGDMR區(qū)域修飾的基礎(chǔ)上，對(duì)H19區(qū)域進(jìn)行同源重組，通

7、過(guò)對(duì)H19轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-4kb到+1kb以及-10kb到+4kb區(qū)域敲除我們發(fā)現(xiàn)，在IGDMR/△5kbH19敲除的單倍體胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)注射后不能獲得到期成活的小鼠，但I(xiàn)GDMR/△15kbH19敲除的單倍體胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)注射不僅動(dòng)物到期率有所提高而且動(dòng)物可以成活到成年，但是其體重及行為學(xué)與野生型相比依舊有所異常。最后，我們通過(guò)在IGDMR/△15kbH19敲除的單倍體胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)行IGF2過(guò)表達(dá)形成IGDMR/△15kbH