早期胚胎發(fā)育過程中印記基因的表達(dá)研究.pdf

1、哺乳動物基因組中，只有很少的基因?qū)儆谟∮浕颍ù蠹s<5％），但在胎兒的整個生長及行為的發(fā)育過程中，這些少量的印記基因卻起著相當(dāng)重要的作用。在哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中，印記基因有兩次重編程過程，一個是受精卵發(fā)育成早期胚胎的過程，另一個是原始生殖細(xì)胞發(fā)育成成熟配子的過程。在這兩次過程中，如果重編程異常，則會引起多種疾病，這些疾病與基因組印記紊亂引起的異常表達(dá)有關(guān)。因此，研究早期胚胎印記基因的表達(dá)調(diào)控非常重要。早期胚胎印記基因研究中，只能用

2、RNA-FISH技術(shù)在細(xì)胞水平上進(jìn)行研究，但其難度大，一次只能檢測一個基因。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，2007年首次在分子水平上實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞檢測技術(shù)。到目前為止已經(jīng)探索了四種不同的單細(xì)胞檢測技術(shù)，分別為：scRNA-Seq3’轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)、RNA-Seq的單細(xì)胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)(Single-cell Tagged Reverse Transcription，STRT)、CEL-Seq技術(shù)和Smart-Seq技術(shù)。第一種技術(shù)準(zhǔn)確度高，但只能檢

3、測mRNA的3’端。后三種技術(shù)則是對完整mRNA進(jìn)行分析，其中STRT技術(shù)在逆轉(zhuǎn)錄過程中易出現(xiàn)斷片；CEL-Seq技術(shù)具有偏好性，擴(kuò)增量大且成本較高；Smart-Seq技術(shù)不穩(wěn)定，且低水平表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組可能會丟失。在本實(shí)驗(yàn)的研究中，只需檢測早期胚胎的3’-UTR區(qū)。根據(jù)這四種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，最終選擇scRNA-Seq3’轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)對早期胚胎印記基因進(jìn)行分析。通過在單細(xì)胞水平上對印記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，可以提供更多的數(shù)據(jù)研究哺乳動物早期胚

4、胎發(fā)育，也為早期胚胎發(fā)育重編程問題的解決提供理論依據(jù)。
　　本研究首先利用生物信息學(xué)在印記基因?qū)I(yè)網(wǎng)站（Geneimprint網(wǎng)站）上查找出父源和母源的印記基因，并對這些基因的表達(dá)來源、SNP位點(diǎn)、小鼠品系之間的差異、染色體位置和屬性進(jìn)行歸納總結(jié)。然后利用Beacon Designer軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫中印記基因的mRNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在此基礎(chǔ)上，采集十個時期（受精卵、早期2細(xì)胞期、中期2細(xì)胞期、晚期2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)

5、胞期、16細(xì)胞期、早期囊胚、中期囊胚和晚期囊胚）的胚胎，利用scRNA-Seq3’轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)對單細(xì)胞進(jìn)行提取及擴(kuò)增，最后再用磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物。純化后的cDNA分別用兩個持家基因（Ddx3x、Pdha1）檢測其表達(dá)，選出有表達(dá)的樣本做RT-qPCR，并進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用單細(xì)胞提取RNA對印記基因的表達(dá)進(jìn)行研究是可行的；印記基因的表達(dá)具有時空特異性，不同發(fā)育時期的胚胎樣品濃度存在差異，基因表達(dá)也存在差異，這個結(jié)果在文獻(xiàn)中得到了