水通道蛋白3在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的表達及在玻璃化凍融過程中的作用.pdf

1、研究背景：
　　水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類介導高效水轉(zhuǎn)運的膜蛋白，廣泛分布于機體組織細胞的胞膜上，介導各種類型細胞膜的水轉(zhuǎn)運,在維持細胞的滲透壓平衡中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的哺乳動物水通道家族已有13個成員(AQP0-AQP12)，根據(jù)其功能主要分為專一性水通道蛋白及甘油水通道蛋白兩大類。甘油水通道蛋白比較特殊，它們不僅可以介導自由水跨膜轉(zhuǎn)運，還可介導一些線性小分子物質(zhì)如甘油、尿素、羥基化合物等

2、的轉(zhuǎn)運，包括AQP3，7，8，9和AQP10。近十年來，AQPs的結(jié)構(gòu)及功能被各學科所關(guān)注。有文獻報道，有11種水通道蛋白（AQP0-AQP10）豐富地表達于哺乳動物的睪丸、精子、卵泡、子宮、胚胎、胎盤、胎膜等組織，參與精子發(fā)生、卵泡發(fā)育成熟、囊胚形成、胚胎著床、母胎液體平衡等生殖過程。AQPs表達于小鼠早期胚胎已多次得到證實，其中，AQP3 mRNA、AQP7mRNA高表達于早期胚胎各發(fā)育時期、AQP8 mRNA高表達于早期囊胚是多項

3、研究結(jié)果的一致之處，且各時期胚胎AQPs的表達情況可隨環(huán)境的改變而發(fā)生變化。
　　自1983年Trounson等取得凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)-ET）的臨床妊娠以來，F(xiàn)-ET已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technology，ART）的重要組成部分，據(jù)統(tǒng)計，全世界應用ART的出生兒中，有25％來自F-ET周期；在ART所有的移植胚胎中，約42

4、%來自凍融胚胎。因此，胚胎凍融技術(shù)在 ART中占有重要地位，且隨著近年來大力提倡單胚胎移植，如何進一步完善胚胎凍融的方法，保障凍融胚胎的復蘇率及質(zhì)量也成為學術(shù)界研究的熱點。
　　有研究指出，細胞的膜滲透性是決定其能否耐受冷凍過程的關(guān)鍵因素，凍融成功的關(guān)鍵在于水和高濃度低溫防護劑在細胞內(nèi)外的快速跨膜轉(zhuǎn)運、分布并達到滲透壓平衡。還有研究表明，早期胚胎在高滲溶液中起應激反應的主要效應之一是AQPs的表達及蛋白定位的變化，且目前除了AQP

5、s外尚未發(fā)現(xiàn)其他可介導水分子跨膜轉(zhuǎn)運的物質(zhì)。那么，AQPs在早期胚胎中的表達特性如何？其如何參與早期胚胎的發(fā)育過程？在哺乳動物早期胚胎的凍融過程中，AQPs特別是甘油水通道蛋白亞族是否就是水和低溫防護劑跨膜轉(zhuǎn)運分布的主要分子途徑？如果是，其作用機制如何？這些問題至今并未得以完全闡明。
　　本研究選取在早期胚胎各階段均有高表達且可能在高滲冷凍防護劑環(huán)境中發(fā)揮作用的AQP3，研究其在小鼠早期胚胎各發(fā)育時期的表達規(guī)律與分布特征，并通過對

6、比胚胎玻璃化冷凍-解凍前后AQP3表達情況的變化，探討AQP3在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的作用及在胚胎凍融過程中的可能調(diào)節(jié)機制。本研究對完善生殖生理學中早期胚胎發(fā)育的機制、闡明胚胎凍融過程中膜調(diào)節(jié)機制具有重要意義，也是發(fā)展胚胎凍融改進方法的重要切入點。
　　研究內(nèi)容：
　　第一部分：AQP3在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的表達及作用
　　目的：
　　檢測小鼠早期胚胎各發(fā)育時期AQP3的表達及分布情況，探討AQP3在小鼠早

7、期胚胎發(fā)育過程中的作用及機制。
　　材料與方法：
　　對實驗小鼠予孕馬血清促性腺激素（PMSG）聯(lián)合絨毛膜促性腺激素（HCG）制備控制性超促排卵（COH）模型，使其交配受孕；手術(shù)法收集不同發(fā)育時期的早期胚胎：四細胞期（HCG注射后60小時）、八細胞期（HCG注射后65-68小時）、桑葚胚期（HCG注射后72-80小時）、早期囊胚（82-90小時）。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測四個時期的胚胎AQP3 mRNA的相

8、對表達量，采用2-△CT法計算各時期胚胎AQP3 mRNA的相對表達量并進行比較，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義；免疫熒光顯微鏡對收集到的各時期胚胎進行AQP3表達的定性檢測；激光共聚焦顯微鏡對各時期胚胎進行AQP3蛋白亞細胞定位分析。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示，小鼠四細胞期、八細胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚均有AQP3 mRNA表達，其中桑葚胚期最高，囊胚期的表達

9、最低，但各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）
　　2.免疫熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，小鼠四細胞期、八細胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚均可檢測到特異性AQP3的陽性信號，陰性對照未檢測到熒光信號。
　　3.激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四細胞期及八細胞期胚胎的特異性 AQP3熒光信號均分布在卵裂球的胞質(zhì)、核膜處，其中均以核膜處的熒光信號較強；桑葚胚的AQP3熒光信號主要分布在各卵裂球的胞膜及各卵裂球連接處；早期囊胚則主要分布滋養(yǎng)

10、層細胞的胞質(zhì)及胞膜中，囊胚腔中也可見熒光信號。
　　結(jié)論：
　　1.AQP3 mRNA表達于小鼠早期胚胎各發(fā)育時期，提示AQP3 mRNA可能參與胚胎基因組的組成，對小鼠早期胚胎的發(fā)育起潛在的調(diào)控作用。
　　2.AQP3的蛋白亞細胞定位在各發(fā)育時期不完全相同，說明其可隨各時期胚胎的發(fā)育需要而發(fā)生表達和功能上相應調(diào)節(jié)。
　　第二部分：水通道蛋白3在小鼠胚胎玻璃化冷凍前后的表達及分布變化
　　目的：
　　

11、比較AQP3在小鼠八細胞期胚胎、桑葚胚及早期囊胚玻璃化凍融前后的表達及分布情況，以探討AQP3在小鼠早期胚胎凍融過程中的可能作用及調(diào)節(jié)機制。
　　材料與方法：
　　制備小鼠 COH模型，顯微鏡下手術(shù)法收集小鼠八細胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚（方法同第一部分）。應用免疫熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、蛋白印記法（Western Blot）檢測以上三個時期新鮮胚胎AQP3的表達、分布情況及蛋白相對表達量；對這三個時期的胚胎進行玻

12、璃化冷凍-解凍，應用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)及Western Blot對凍融后三個時期的胚胎AQP3的表達、分布情況及蛋白相對表達量進行檢測，并與同時期新鮮胚胎進行對比分析。重復實驗3次。Western Blot以GAPDH條帶為內(nèi)參進行蛋白上樣量校正，條帶采用Image Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件進行分析，取平均值進行計算，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：

13、>　　1.免疫熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，在冷凍前、凍融后的各時期胚胎均可檢測到明顯的特異性AQP3的陽性、信號，陰性對照未檢測到熒光信號。
　　2.激光共聚焦掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮胚胎：八細胞期胚胎的綠色熒光均質(zhì)分布在卵裂球的核膜、胞質(zhì)處，其中核膜處熒光信號較強；桑葚胚的綠色熒光較均質(zhì)分布在各卵裂球的胞膜；早期囊胚主要分布在滋養(yǎng)層細胞的胞質(zhì)、胞膜中，囊胚腔內(nèi)也可見熒光信號。凍融復蘇后胚胎：八細胞期胚胎的綠色熒光呈明顯小顆粒狀分布于卵裂球

14、的胞膜、胞質(zhì)，少數(shù)分布于核膜處；桑葚胚主要分布于胞膜；早期囊胚主要分布于滋養(yǎng)層細胞的胞膜、胞質(zhì)中。
　　3.Western Blot檢測到各組胚胎凍融前后均有AQP3表達，以校正值K（AQP3條帶IOD/GAPDH條帶IOD）進行半定量分析，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：胚胎冷凍前，八細胞期AQP3相對表達量最高，其次為早期囊胚，桑葚胚期最低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；胚胎凍融后，桑葚胚期 AQP3相對表達量最高，其次為八細胞期，

15、早期囊胚期最低，組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。八細胞期及早期囊胚凍融后AQP3相對表達量均顯著低于冷凍前（P<0.05），而桑葚胚期則高于冷凍前（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.AQP3在KM小鼠新鮮胚胎的蛋白亞細胞定可位隨各發(fā)育時期的不同而顯示不同的表達模式，而經(jīng)過玻璃化冷凍-解凍，各時期復蘇胚胎的AQP3蛋白定位都主要位于胞膜上，提示 AQP3可能在小鼠早期胚胎各時期的凍融過程中均主要介導胚胎與外界的液體