小鼠精源性非編碼小RNAs在受精及早期胚胎發(fā)育過程中的作用研究.pdf

1、目的：
　　人們早已發(fā)現(xiàn)，小鼠和人類的精子中存在大量的RNA（包括mRNA，非編碼長鏈RNA和非編碼小RNA），并通過受精過程將它們帶入卵母細(xì)胞和早期胚胎，并可能對受精和早期胚胎發(fā)育過程有一定的潛在作用。精子中的這些RNA，我們稱之為精源性RNAs，這些精源性RNAs不僅包括來源于分化的生殖細(xì)胞的mRNA，還包括一些參與精子發(fā)生并能對精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的非編碼小RNA分子，如小干擾RNA(siRNAs)，微小RNA(

2、miRNAs)和piwi-互作RNA(piRNAs)。但迄今為止，人們對這些精源性RNA，特別是精源性非編碼小RNAs(Small non-coding RNAs，SncRNAs)是否在受精和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用還存有疑問，對精源性SncRNAs在著床前胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制也仍不清楚。
　　目前人們已經(jīng)基本闡明了兩種非編碼小RNA:微小RNA(miRNA)和內(nèi)源性干擾小RNA(endo-siRNA)的經(jīng)典生物合成、遺傳途

3、徑及作用機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)有兩種關(guān)鍵的RNaseⅢ內(nèi)切酶——位于細(xì)胞核微處理器中的DROSHA/DGCR8復(fù)合體和位于細(xì)胞質(zhì)中的DICER，參與miRNA的加工合成。DROSHA能夠識別來源于RNA多聚酶Ⅱ從一個(gè)miRNA基因位點(diǎn)或一簇miRNA基因形成的位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而成的長的初始片段的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，然后聯(lián)合DGCR8將帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初始miRNA轉(zhuǎn)變成miRNA前體(Pri-miRNA)。和DROSHA不同的是，DICER不僅能夠切割初始miRN

4、A的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)而且能夠切割外源性導(dǎo)入的或細(xì)胞自然產(chǎn)生的雙鏈RNA使其轉(zhuǎn)變成小RNA，如miRNA，siRNA和endo-siRNA。因而，敲除DICER能影響DICER依賴性的小RNA的生成，如miRNA和endo-siRNA的生成;而敲除DROSHA或DGCR8則能影響miRNA前體和成熟miRNA的生成。因此，本研究應(yīng)用條件性敲除生殖細(xì)胞中的DICER和/或DROSHA的小鼠模型(Dicer cKO或Drosha cKO)，在生物學(xué)

5、條件下敲除配子（精子細(xì)胞或卵母細(xì)胞）中的miRNAs和/或endo-siRNAs，結(jié)合卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）以研究精源性SncRNAs在受精及早期胚胎發(fā)育中的作用，同時(shí)運(yùn)用高通量小RNA深測序及分子生物信息學(xué)手段分析比較條件性敲除精子細(xì)胞中的SncRNAs的組成及表達(dá)水平的變化，從更深層次上揭示精源性SncRNAs的作用與機(jī)制，從而為精源性SncRNAs是否可

6、以作為臨床男性不育癥診療的指標(biāo)提供新的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、C57BL/6J背景的野生型小鼠、條件性敲除工具小鼠Stra8-iCre和ZP3-iCre和Loxp小鼠Dicerlox/lox、Droshalox/lox以及監(jiān)測CRE重組酶的Rosa26-mTmGTg/Tg小鼠。
　　2、小鼠基因型檢測及免疫熒光檢測相關(guān)試劑
　　3、大、小RNA提取相關(guān)試劑
　　4、卵胞

7、漿內(nèi)單精子注射及早期胚胎培養(yǎng)相關(guān)試劑
　　5、實(shí)時(shí)定量PCR及單細(xì)胞PCR相關(guān)試劑
　　6、小RNA深測序分析相關(guān)試劑
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬l件性敲除生殖細(xì)胞系中Dicer或Drosha的小鼠模型建立及繁育
　　采用Cre-Loxp系統(tǒng)進(jìn)行繁育。Stra8-iCre工具小鼠分別與Dicerlox/lox和Droshalox/lox小鼠進(jìn)行繁育從而得到雄性生殖細(xì)胞條件性敲除Dicer或Drosha的小

8、鼠。Zp3-iCre工具小鼠與Droshalox/lox小鼠進(jìn)行繁育從而得到雌性生殖細(xì)胞條件性敲除Drosha的小鼠。
　?。ǘl件性敲除生殖細(xì)胞系中Dicer或Drosha的小鼠基因型檢測
　　敲除小鼠的基因表現(xiàn)型通過常規(guī)PCR的方法鑒定，大約在子代小鼠出生后10天左右剪尾巴后，提取小鼠基因組DNA，然后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增目的基因片段以鑒定基因的純合、雜合或缺失。
　?。ㄈ┬∈蟛G丸重量、精子活動率及密度分析測定<

9、br>　　小鼠脫臼法處死后，用手術(shù)鑷子和剪刀小心取出睪丸和附睪尾并放在無菌的濾紙上除去部分血管和脂肪，立即稱重并在光學(xué)解剖顯微鏡下拍照。精子從附睪中取出后，使用計(jì)算機(jī)輔助分析儀進(jìn)行活動率及密度的測定。
　　（四）小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)及熒光化學(xué)分析
　　小鼠睪丸于Bouin's液中過夜固定，70％乙醇洗滌數(shù)次后再用石臘包埋成切塊。用石臘切片機(jī)將包埋塊切成5im超薄切片，然后進(jìn)行Periodic-acid Schiff(PAS)染

10、色后進(jìn)行照相分析。小鼠睪丸用含4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液在室溫固定3～4小時(shí)后，再在5～20％的梯度蔗糖溶液中洗滌后用1∶1的O.C.T和20％的蔗糖混合物包埋制成冰凍切片塊，在冰凍切片機(jī)上切成10im的超薄切片進(jìn)行熒光分析。
　?。ㄎ澹┬∈笾埠笈咛サ姆蛛x及其基因型檢測
　　脫臼處死懷孕雌鼠，打開腹腔用眼科剪刀和鑷子小心分離雙側(cè)子宮系膜，在光學(xué)解剖顯微鏡下依次從子宮中切下胚泡，用眼科尖鑷子小心的分開蛻膜，漏出胚胎，

11、再用閉合的鑷子尖將其輕輕剝離出來并用常規(guī)PCR檢測其基因型。
　?。┞涯讣?xì)胞及早期胚胎的免疫熒光分析觀察
　　將卵母細(xì)胞或胚胎用HEPES-CZB溶液潤洗幾次后置于含4％的多聚甲醛HEPES-CZB溶液中固定1小時(shí)，潤洗3次后，將固定后的卵母細(xì)胞和胚胎轉(zhuǎn)入含0.2％ TritonX-100的PBS溶液中放置15分鐘，再轉(zhuǎn)入封閉溶液（含2％BSA的PBS溶液）中封閉1小時(shí)，然后在第一抗體中孵育1小時(shí)，再轉(zhuǎn)入熒光結(jié)合的種間特

12、異性第二抗體中避光孵育1小時(shí)。最后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚雙乳酸鹽(DAPI)進(jìn)行復(fù)染色，用熒光顯微鏡（Zeiss，HAL100進(jìn)行檢測并照相。
　?。ㄆ撸┚雍吐涯讣?xì)胞RNA抽提
　　精子和卵母細(xì)胞中的大、小RNA抽提分別使用PureLinkTM RNA提取試劑盒和mirVanaTMmiRNA提取試劑盒，參照說明書進(jìn)行。
　?。ò耍?shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR
　　RNA用DNA酶處理后，使用Invitroge

13、n公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對目標(biāo)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后將獲得的cDNA作為模板，并加入特異的引物，在SYBR Green發(fā)光混合酶復(fù)合物的監(jiān)測下上機(jī)進(jìn)行定量PCR。
　　（九）卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)
　　在Piezo的脈沖驅(qū)動下將預(yù)先制備的單個(gè)精子頭注射進(jìn)MII期卵母細(xì)胞胞漿中，每次注射大約10～15個(gè)卵母細(xì)胞，注射完畢后，立即將其轉(zhuǎn)移到礦物油覆蓋的KSOM+AA培養(yǎng)液滴中，并置于37℃、含5％CO2的潮濕空氣的二氧化碳培

14、養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)觀察。
　?。ㄊ┬∈笈咛ヒ浦?br>　　通常在胚胎移植的前一天晚上將用作代孕的CD-1（白色）雌性小鼠與輸精管結(jié)扎的CD-1雄性小鼠進(jìn)行合籠交配，第二天早晨檢查交配情況，見有陰道栓的雌性小鼠即可用作當(dāng)天的代孕母鼠，然后將發(fā)育至2-PN階段或2-細(xì)胞階段的胚胎在體視顯微鏡下移植到代孕雌性CD-1小鼠的單側(cè)或雙側(cè)輸卵管中。
　?。ㄊ唬└咄繂蝹€(gè)細(xì)胞qPCR
　　整個(gè)單細(xì)胞qPCR過程可分為兩個(gè)部分，第一部

15、分由反轉(zhuǎn)錄（RT）和特異靶片段擴(kuò)增(STA)兩個(gè)主要的過程組成。首先用反轉(zhuǎn)錄酶將單個(gè)細(xì)胞中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，接著使用目的基因的96對引物的混合稀釋液，進(jìn)行特異片段的PCR擴(kuò)增。第二部分，使用BiomarkTM HD系統(tǒng)(Fluidigm，South SanFrancisco，CA)，在96×96的芯片上進(jìn)行特殊片段的qPCR反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)通過Biomark PCR實(shí)時(shí)分析軟件讀取。
　?。ㄊ┚蛹?xì)胞中的小RNA的深層測

16、序
　　使用Ion總RNA序列套裝建立小RNA的cDNA數(shù)據(jù)庫。將提取到的小RNA綁定到離子編碼序列上，用互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄底物使離子編碼退火來啟動反轉(zhuǎn)錄過程，并通過ArrayScript反轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)的cDNA。接著，將精子小RNA反轉(zhuǎn)錄來的cDNA通過Novex TBE/urea膠體系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行大小篩選，再使用AmpliTaq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。這一過程通過Ion OneTouch(Invitrogen)配合

17、Ion OneTouch模板套裝(Invitrogen)來完成。獲得的數(shù)據(jù)使用t-map離子連發(fā)校正儀(Invitrogen)對讀取的序列進(jìn)行校正，然后用Partek基因組套件(版本6.6 beta，Partek，St.Louis，MO)對校正后的讀數(shù)進(jìn)行分析。
　?。ㄊ┙y(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　研究中的所得數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)(Chi-Square)和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，P＜0.05定義為存在顯著性差異，P＜0.01被

18、認(rèn)為存在極顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　一、生殖細(xì)胞敲除Dicer和/或Drosha小鼠的表型分析結(jié)果
　　條件性敲除雄性小鼠生殖細(xì)胞中Dicer或Drosha后均導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生障礙，表現(xiàn)為精子密度減少、精子活動率下降而致使小鼠不育。條件性敲除雌性小鼠生殖細(xì)胞中的Drosha后不影響卵母細(xì)胞的生成，但雌性小鼠表現(xiàn)出亞不孕現(xiàn)象。全身性敲除小鼠體內(nèi)Drosha則導(dǎo)致小鼠于胚胎期7.5天死亡。
　　二、Dicer或D

19、rosha cKO小鼠精子細(xì)胞中Dicer和Drosha的mRNA表達(dá)水平分析結(jié)果
　　相比野生型小鼠精子細(xì)胞，Dicer cKO小鼠精子細(xì)胞中的Dicer和Drosha的mRNA表達(dá)水平均顯著性下降，而Drosha cKO小鼠精子細(xì)胞中的Dicer的mRNA表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化，Drosha的mRNA表達(dá)水平顯著性降低。
　　三、Drosha cKO小鼠卵母細(xì)胞中Drosha的mRNA及蛋白表達(dá)水平分析結(jié)果
　　相

20、比野生型小鼠卵母細(xì)胞，Drosha cKO小鼠卵母細(xì)胞中Drosha的mRNA表達(dá)水平顯著性降低，但在Drosha cKO小鼠GV期卵母細(xì)胞中仍然可以檢測到DROSHA截短蛋白(truncated protein)的存在。
　　四、Dicer或Drosha cKO精子對卵母細(xì)胞受精及受精后發(fā)育的作用結(jié)果
　　Dicer cKO和Drosha cKO精子通過ICSI均能使野生型小鼠卵母細(xì)胞受精并啟動胚胎發(fā)育過程。但Dicer

21、cKO精子的受精率極顯著低于對照組，各階段的胚胎發(fā)育率也極顯著的低于對照組;而Drosha cKO精子的受精率和2-細(xì)胞胚發(fā)育率均正常，但當(dāng)胚胎進(jìn)一步發(fā)育到4-細(xì)胞階段后，相比對照組胚胎發(fā)育率就開始極顯著性降低(P＜0.01)。
　　五、源于Dicer cKO和Drosha cKO精子的不同階段胚胎的基因表達(dá)差異比較結(jié)果
　　使用單細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR對源于Dicer cKO和Drosha cKO精子ICSI后不同階段胚胎的9

22、6個(gè)基因進(jìn)行定量表達(dá)分析，與野生型精子相比，Dicer cKO精子和Drosha cKO精子ICSI后生成的胚胎中的很多支持胚胎發(fā)育的必需基因在不同的胚胎階段出現(xiàn)了很大的表達(dá)差異。
　　六、Dicer或Drosha cKO精子ICSI后的2PN和2-細(xì)胞階段胚胎的組蛋白修飾水平變化結(jié)果
　　免疫熒光顯示Dicer或Drosha cKO精子ICSI后的早期胚胎（2PN和2-細(xì)胞階段）中的組蛋白修飾水平未見顯著性變化。
　

23、　七、Dicer cKO和Drosha cKO精子中非編碼小RNAs（miRNAs和endo-siRNAs）深測序差異比較結(jié)果
　　相比野生型小鼠精子，Dicer cKO和Drosha cKO精子中非編碼小RNAs的構(gòu)成比例未見顯著性改變，但約有80％的miRNAs在Dicer cKO和Drosha cKO精子中的表達(dá)水平發(fā)生改變（上調(diào)或下調(diào)），約87％的endo-siRNAs的表達(dá)水平在Dicer cKO精子中發(fā)生改變，有61％

24、的endo-siRNAs的表達(dá)水平在Drosha cKO精子中的表達(dá)發(fā)生改變。
　　結(jié)論：
　　1、全身性敲除小鼠細(xì)胞中Drosha會導(dǎo)致小鼠在胚胎期7.5天死亡。
　　2、敲除卵母細(xì)胞中Drosha不影響卵母細(xì)胞成熟、生長、受精和早期胚胎發(fā)育，但會導(dǎo)致雌性小鼠的亞不孕(Sub-fertile)。
　　3、條件性敲除小鼠生殖細(xì)胞中的Dicer或Drosha均導(dǎo)致雄性小鼠精子發(fā)生障礙而致使小鼠不育。
　　4、