小鼠精源性非編碼小RNAs在受精及早期胚胎發(fā)育過程中的作用研究.pdf

1、目的：
　　人們早已發(fā)現，小鼠和人類的精子中存在大量的RNA（包括mRNA，非編碼長鏈RNA和非編碼小RNA），并通過受精過程將它們帶入卵母細胞和早期胚胎，并可能對受精和早期胚胎發(fā)育過程有一定的潛在作用。精子中的這些RNA，我們稱之為精源性RNAs，這些精源性RNAs不僅包括來源于分化的生殖細胞的mRNA，還包括一些參與精子發(fā)生并能對精子發(fā)生過程中的基因表達進行調控的非編碼小RNA分子，如小干擾RNA(siRNAs)，微小RNA(

2、miRNAs)和piwi-互作RNA(piRNAs)。但迄今為止，人們對這些精源性RNA，特別是精源性非編碼小RNAs(Small non-coding RNAs，SncRNAs)是否在受精和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用還存有疑問，對精源性SncRNAs在著床前胚胎發(fā)育過程中的作用機制也仍不清楚。
　　目前人們已經基本闡明了兩種非編碼小RNA:微小RNA(miRNA)和內源性干擾小RNA(endo-siRNA)的經典生物合成、遺傳途

3、徑及作用機制，并發(fā)現有兩種關鍵的RNaseⅢ內切酶——位于細胞核微處理器中的DROSHA/DGCR8復合體和位于細胞質中的DICER，參與miRNA的加工合成。DROSHA能夠識別來源于RNA多聚酶Ⅱ從一個miRNA基因位點或一簇miRNA基因形成的位點轉錄而成的長的初始片段的莖-環(huán)結構，然后聯合DGCR8將帶有莖環(huán)結構的初始miRNA轉變成miRNA前體(Pri-miRNA)。和DROSHA不同的是，DICER不僅能夠切割初始miRN

4、A的莖-環(huán)結構而且能夠切割外源性導入的或細胞自然產生的雙鏈RNA使其轉變成小RNA，如miRNA，siRNA和endo-siRNA。因而，敲除DICER能影響DICER依賴性的小RNA的生成，如miRNA和endo-siRNA的生成;而敲除DROSHA或DGCR8則能影響miRNA前體和成熟miRNA的生成。因此，本研究應用條件性敲除生殖細胞中的DICER和/或DROSHA的小鼠模型(Dicer cKO或Drosha cKO)，在生物學

5、條件下敲除配子（精子細胞或卵母細胞）中的miRNAs和/或endo-siRNAs，結合卵胞漿內單精子注射技術（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）以研究精源性SncRNAs在受精及早期胚胎發(fā)育中的作用，同時運用高通量小RNA深測序及分子生物信息學手段分析比較條件性敲除精子細胞中的SncRNAs的組成及表達水平的變化，從更深層次上揭示精源性SncRNAs的作用與機制，從而為精源性SncRNAs是否可

6、以作為臨床男性不育癥診療的指標提供新的理論依據。
　　材料與方法：
　　一、實驗材料
　　1、C57BL/6J背景的野生型小鼠、條件性敲除工具小鼠Stra8-iCre和ZP3-iCre和Loxp小鼠Dicerlox/lox、Droshalox/lox以及監(jiān)測CRE重組酶的Rosa26-mTmGTg/Tg小鼠。
　　2、小鼠基因型檢測及免疫熒光檢測相關試劑
　　3、大、小RNA提取相關試劑
　　4、卵胞

7、漿內單精子注射及早期胚胎培養(yǎng)相關試劑
　　5、實時定量PCR及單細胞PCR相關試劑
　　6、小RNA深測序分析相關試劑
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬l件性敲除生殖細胞系中Dicer或Drosha的小鼠模型建立及繁育
　　采用Cre-Loxp系統進行繁育。Stra8-iCre工具小鼠分別與Dicerlox/lox和Droshalox/lox小鼠進行繁育從而得到雄性生殖細胞條件性敲除Dicer或Drosha的小

8、鼠。Zp3-iCre工具小鼠與Droshalox/lox小鼠進行繁育從而得到雌性生殖細胞條件性敲除Drosha的小鼠。
　　（二）條件性敲除生殖細胞系中Dicer或Drosha的小鼠基因型檢測
　　敲除小鼠的基因表現型通過常規(guī)PCR的方法鑒定，大約在子代小鼠出生后10天左右剪尾巴后，提取小鼠基因組DNA，然后進行常規(guī)PCR擴增目的基因片段以鑒定基因的純合、雜合或缺失。
　　（三）小鼠睪丸重量、精子活動率及密度分析測定<

9、br>　　小鼠脫臼法處死后，用手術鑷子和剪刀小心取出睪丸和附睪尾并放在無菌的濾紙上除去部分血管和脂肪，立即稱重并在光學解剖顯微鏡下拍照。精子從附睪中取出后，使用計算機輔助分析儀進行活動率及密度的測定。
　?。ㄋ模┬∈蟛G丸組織形態(tài)學及熒光化學分析
　　小鼠睪丸于Bouin's液中過夜固定，70％乙醇洗滌數次后再用石臘包埋成切塊。用石臘切片機將包埋塊切成5im超薄切片，然后進行Periodic-acid Schiff(PAS)染

10、色后進行照相分析。小鼠睪丸用含4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液在室溫固定3～4小時后，再在5～20％的梯度蔗糖溶液中洗滌后用1∶1的O.C.T和20％的蔗糖混合物包埋制成冰凍切片塊，在冰凍切片機上切成10im的超薄切片進行熒光分析。
　?。ㄎ澹┬∈笾埠笈咛サ姆蛛x及其基因型檢測
　　脫臼處死懷孕雌鼠，打開腹腔用眼科剪刀和鑷子小心分離雙側子宮系膜，在光學解剖顯微鏡下依次從子宮中切下胚泡，用眼科尖鑷子小心的分開蛻膜，漏出胚胎，

11、再用閉合的鑷子尖將其輕輕剝離出來并用常規(guī)PCR檢測其基因型。
　?。┞涯讣毎霸缙谂咛サ拿庖邿晒夥治鲇^察
　　將卵母細胞或胚胎用HEPES-CZB溶液潤洗幾次后置于含4％的多聚甲醛HEPES-CZB溶液中固定1小時，潤洗3次后，將固定后的卵母細胞和胚胎轉入含0.2％ TritonX-100的PBS溶液中放置15分鐘，再轉入封閉溶液（含2％BSA的PBS溶液）中封閉1小時，然后在第一抗體中孵育1小時，再轉入熒光結合的種間特

12、異性第二抗體中避光孵育1小時。最后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚雙乳酸鹽(DAPI)進行復染色，用熒光顯微鏡（Zeiss，HAL100進行檢測并照相。
　　（七）精子和卵母細胞RNA抽提
　　精子和卵母細胞中的大、小RNA抽提分別使用PureLinkTM RNA提取試劑盒和mirVanaTMmiRNA提取試劑盒，參照說明書進行。
　?。ò耍崟r定量反轉錄PCR
　　RNA用DNA酶處理后，使用Invitroge

13、n公司的反轉錄試劑盒對目標RNA進行逆轉錄，然后將獲得的cDNA作為模板，并加入特異的引物，在SYBR Green發(fā)光混合酶復合物的監(jiān)測下上機進行定量PCR。
　　（九）卵胞漿內單精子注射(ICSI)
　　在Piezo的脈沖驅動下將預先制備的單個精子頭注射進MII期卵母細胞胞漿中，每次注射大約10～15個卵母細胞，注射完畢后，立即將其轉移到礦物油覆蓋的KSOM+AA培養(yǎng)液滴中，并置于37℃、含5％CO2的潮濕空氣的二氧化碳培

14、養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)觀察。
　?。ㄊ┬∈笈咛ヒ浦?br>　　通常在胚胎移植的前一天晚上將用作代孕的CD-1（白色）雌性小鼠與輸精管結扎的CD-1雄性小鼠進行合籠交配，第二天早晨檢查交配情況，見有陰道栓的雌性小鼠即可用作當天的代孕母鼠，然后將發(fā)育至2-PN階段或2-細胞階段的胚胎在體視顯微鏡下移植到代孕雌性CD-1小鼠的單側或雙側輸卵管中。
　?。ㄊ唬└咄繂蝹€細胞qPCR
　　整個單細胞qPCR過程可分為兩個部分，第一部

15、分由反轉錄（RT）和特異靶片段擴增(STA)兩個主要的過程組成。首先用反轉錄酶將單個細胞中的RNA反轉錄為cDNA，接著使用目的基因的96對引物的混合稀釋液，進行特異片段的PCR擴增。第二部分，使用BiomarkTM HD系統(Fluidigm，South SanFrancisco，CA)，在96×96的芯片上進行特殊片段的qPCR反應，所得數據通過Biomark PCR實時分析軟件讀取。
　?。ㄊ┚蛹毎械男NA的深層測

16、序
　　使用Ion總RNA序列套裝建立小RNA的cDNA數據庫。將提取到的小RNA綁定到離子編碼序列上，用互補的反轉錄底物使離子編碼退火來啟動反轉錄過程，并通過ArrayScript反轉錄生成相應的cDNA。接著，將精子小RNA反轉錄來的cDNA通過Novex TBE/urea膠體系統(Invitrogen)進行大小篩選，再使用AmpliTaq DNA聚合酶進行擴增。這一過程通過Ion OneTouch(Invitrogen)配合

17、Ion OneTouch模板套裝(Invitrogen)來完成。獲得的數據使用t-map離子連發(fā)校正儀(Invitrogen)對讀取的序列進行校正，然后用Partek基因組套件(版本6.6 beta，Partek，St.Louis，MO)對校正后的讀數進行分析。
　　（十三）統計學分析
　　研究中的所得數據采用卡方檢驗(Chi-Square)和SPSS16.0統計分析軟件進行，P＜0.05定義為存在顯著性差異，P＜0.01被

18、認為存在極顯著性差異。
　　結果：
　　一、生殖細胞敲除Dicer和/或Drosha小鼠的表型分析結果
　　條件性敲除雄性小鼠生殖細胞中Dicer或Drosha后均導致小鼠精子發(fā)生障礙，表現為精子密度減少、精子活動率下降而致使小鼠不育。條件性敲除雌性小鼠生殖細胞中的Drosha后不影響卵母細胞的生成，但雌性小鼠表現出亞不孕現象。全身性敲除小鼠體內Drosha則導致小鼠于胚胎期7.5天死亡。
　　二、Dicer或D

19、rosha cKO小鼠精子細胞中Dicer和Drosha的mRNA表達水平分析結果
　　相比野生型小鼠精子細胞，Dicer cKO小鼠精子細胞中的Dicer和Drosha的mRNA表達水平均顯著性下降，而Drosha cKO小鼠精子細胞中的Dicer的mRNA表達水平未發(fā)生顯著變化，Drosha的mRNA表達水平顯著性降低。
　　三、Drosha cKO小鼠卵母細胞中Drosha的mRNA及蛋白表達水平分析結果
　　相

20、比野生型小鼠卵母細胞，Drosha cKO小鼠卵母細胞中Drosha的mRNA表達水平顯著性降低，但在Drosha cKO小鼠GV期卵母細胞中仍然可以檢測到DROSHA截短蛋白(truncated protein)的存在。
　　四、Dicer或Drosha cKO精子對卵母細胞受精及受精后發(fā)育的作用結果
　　Dicer cKO和Drosha cKO精子通過ICSI均能使野生型小鼠卵母細胞受精并啟動胚胎發(fā)育過程。但Dicer

21、cKO精子的受精率極顯著低于對照組，各階段的胚胎發(fā)育率也極顯著的低于對照組;而Drosha cKO精子的受精率和2-細胞胚發(fā)育率均正常，但當胚胎進一步發(fā)育到4-細胞階段后，相比對照組胚胎發(fā)育率就開始極顯著性降低(P＜0.01)。
　　五、源于Dicer cKO和Drosha cKO精子的不同階段胚胎的基因表達差異比較結果
　　使用單細胞實時定量PCR對源于Dicer cKO和Drosha cKO精子ICSI后不同階段胚胎的9

22、6個基因進行定量表達分析，與野生型精子相比，Dicer cKO精子和Drosha cKO精子ICSI后生成的胚胎中的很多支持胚胎發(fā)育的必需基因在不同的胚胎階段出現了很大的表達差異。
　　六、Dicer或Drosha cKO精子ICSI后的2PN和2-細胞階段胚胎的組蛋白修飾水平變化結果
　　免疫熒光顯示Dicer或Drosha cKO精子ICSI后的早期胚胎（2PN和2-細胞階段）中的組蛋白修飾水平未見顯著性變化。
　

23、　七、Dicer cKO和Drosha cKO精子中非編碼小RNAs（miRNAs和endo-siRNAs）深測序差異比較結果
　　相比野生型小鼠精子，Dicer cKO和Drosha cKO精子中非編碼小RNAs的構成比例未見顯著性改變，但約有80％的miRNAs在Dicer cKO和Drosha cKO精子中的表達水平發(fā)生改變（上調或下調），約87％的endo-siRNAs的表達水平在Dicer cKO精子中發(fā)生改變，有61％

24、的endo-siRNAs的表達水平在Drosha cKO精子中的表達發(fā)生改變。
　　結論：
　　1、全身性敲除小鼠細胞中Drosha會導致小鼠在胚胎期7.5天死亡。
　　2、敲除卵母細胞中Drosha不影響卵母細胞成熟、生長、受精和早期胚胎發(fā)育，但會導致雌性小鼠的亞不孕(Sub-fertile)。
　　3、條件性敲除小鼠生殖細胞中的Dicer或Drosha均導致雄性小鼠精子發(fā)生障礙而致使小鼠不育。
　　4、