牛早期胚胎發(fā)育過程中差異表達(dá)基因及其作用的研究.pdf

1、為了研究早期牛胚胎體母性基因調(diào)控期、合子基因調(diào)控期基因表達(dá)變化的模式，研究牛早期胚胎發(fā)育中關(guān)鍵基因的作用，本研究使用單個(gè)胚胎mRNA差異法，篩選牛體外受精8細(xì)胞期和囊胚期胚胎中表達(dá)不同的基因。構(gòu)建篩選出基因的過表達(dá)及干擾載體；用脂質(zhì)體和電穿孔法將構(gòu)建好的兩種載體分別轉(zhuǎn)入牛胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，建立起差異基因的過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞系，既可為研究差異基因?qū)?xì)胞生長發(fā)育的影響提供細(xì)胞模型，也可以作為通過體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因

2、胚胎的核供體，進(jìn)一步研究體外牛胚胎發(fā)育過程中相關(guān)差異表達(dá)基因的作用。
　　 1.牛胚胎8細(xì)胞期、囊胚期胚胎差異表達(dá)基因的篩選
　　 通過體外受精獲得牛8細(xì)胞期和囊胚胚胎早期胚胎，采用單個(gè)胚胎mRNA差異顯示技術(shù)，篩選胚胎發(fā)育兩個(gè)時(shí)期表達(dá)模式不同的基因，共得到6條基因片段。將6條片段克隆后測序，在GenBank中尋找同源序列，其中2個(gè)與已知的功能基因序列有較高的同源性，分別為LYAR、RPL31基因；剩余4條未找到同源序列

3、。
　　 采用反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定所篩選到LYAR、RPL31基因在早期胚胎中的表達(dá)。結(jié)果顯示LYAR、RPL31的mRNA在兩個(gè)時(shí)期都有表達(dá)。而后利用實(shí)時(shí)定量PCR方法對2個(gè)基因在牛8細(xì)胞期和囊胚期胚胎中的mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)LYAR，RPL31在牛8細(xì)胞期胚胎中mRNA的相對表達(dá)量分別是囊胚的46倍和3.2倍。
　　 2.構(gòu)建過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31和干擾載體pGCsi-LY

4、AR/RPL31
　　 (1)通過反轉(zhuǎn)錄PCR法從牛8細(xì)胞胚胎總RNA中擴(kuò)增編碼區(qū)cDNA序列，進(jìn)而克隆LYAR/RPL31基因的CDS編碼序列。以雙順反子載體pIRES2-EGFP為骨架，將LYAR/RPL31基因定向連接在SalⅠ+BglⅡ位點(diǎn)，構(gòu)建LYAR/RPL31兩個(gè)基因的過表達(dá)載體。測序結(jié)果表明克隆基因序列正確；限制性內(nèi)切酶分析表明基因連入方向正確，本研究中所構(gòu)建的pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31過表達(dá)載

5、體序列與結(jié)構(gòu)均符合預(yù)期設(shè)計(jì)。
　　 (2)分別針對牛LYAR/RPL31基因的5’-CAGAGGCCAAGAAGAATAAGA-3’/5’-CACAAGCGCATCCATGGAGTG-3’設(shè)計(jì)發(fā)卡干擾片段，并將其連接在骨架載體pGCsi-DsRed上，構(gòu)建pGCsi-LYAR/RPL31干擾載體。
　　 3.牛胎兒成纖維上的外源基因轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選和鑒定
　　 組織塊貼壁法分離40-50天胎齡的牛胎兒成纖

6、維細(xì)胞，放入37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，采用DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)和傳代；DMEM/F12+10％DMSO+20％FBS冷凍保護(hù)液中冷凍保存各代成纖維細(xì)胞。細(xì)胞生長活力分析選用第5、第10代細(xì)胞的生長曲線；染色體數(shù)目分析選用第5代細(xì)胞中期染色體圖，同時(shí)進(jìn)行了G418對牛胎兒成纖維細(xì)胞對毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)后傳代2-3次獲得了較純的胎兒成纖維細(xì)胞；牛胎兒成纖維細(xì)胞的生長速度隨代次增加逐漸放緩；第5代

7、染色體數(shù)目正常(2n=60)。最終確定選用第3代的胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)，確定800μg/ml G418為最佳抗性篩選濃度。
　　 分別采用脂質(zhì)體法和電穿孔法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用real-time quantitative PCR技術(shù)相對定量檢測載體的轉(zhuǎn)染效果。與空載體轉(zhuǎn)染對照組相比，pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中LYAR/RPL31的mRNA表達(dá)量顯著升高

8、(分別是對照組的31.23/45.99倍，P<0.05)，pGCsi-LYAR/RPL31干擾載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中LYAR/RPL31mRNA表達(dá)量則明顯降低，差異顯著(分別是對照組的0.047/0.068倍，P<0.05)，證明構(gòu)建的過表達(dá)載體和干擾載體具預(yù)期的功能，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可用于篩選建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入含有800μg/ml篩選濃度的G418的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱37℃、5％CO2飽和濕度條件下高壓篩選，獲得的抗性克隆細(xì)

9、胞經(jīng)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，分別建立了穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，作為差異基因?qū)?xì)胞生長發(fā)育的影響的細(xì)胞模型?？梢詾橥ㄟ^體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供核供體，制做轉(zhuǎn)基因胚胎模型，為進(jìn)一步研究LYAR/RPL31在體外牛胚胎發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.牛胚胎差異表達(dá)基因功能的研究
　　 繪制轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長曲線，結(jié)果顯示過表達(dá)細(xì)胞系生長狀態(tài)與普通成纖維細(xì)胞無明顯差異；但LYAR/RPL31低表達(dá)后造成細(xì)胞活力明顯降低，生長

10、緩慢。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明，LYAR低表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，RPL31低表達(dá)細(xì)胞中略有增加。
　　 為了確定合適的重構(gòu)胚激活與發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)，首先進(jìn)行了孤雌胚的激活與體外發(fā)育培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將成熟后排出第一極體的牛卵母細(xì)胞置于含有7％乙醇的SOF+BSA發(fā)育液中激活7min，隨后放入含2 mM6-DMAP的SOF+BSA發(fā)育液中培養(yǎng)4 hr，然后移入40μlSOF+BSA的發(fā)育液小滴中培養(yǎng)48hr，卵裂率

11、為74.9％；發(fā)育培養(yǎng)7-9天，囊胚率為24.9％。結(jié)果說明，在該培養(yǎng)系統(tǒng)下牛孤雌胚胎發(fā)育率正常，該系統(tǒng)適合牛核移植重構(gòu)胚的激活與體外發(fā)育培養(yǎng)。
　　 核移植重構(gòu)胚采用上述方案進(jìn)行激活和體外發(fā)育培養(yǎng)?？寺∨咛ソ?jīng)發(fā)育培養(yǎng)，于激活后第八天統(tǒng)計(jì)發(fā)育率和囊胚細(xì)胞數(shù)。體細(xì)胞克隆胚、pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚及pGCsi-LYAR/RPL31克隆胚囊胚發(fā)育率分別為27.9％、26.1％/25.0％和10.3％/11.

12、7％；各組囊胚細(xì)胞數(shù)分別為93、97/92、65/73。結(jié)果表明，體細(xì)胞克隆胚胎對照組與pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚胎在囊胚發(fā)育率方面沒有顯著差異，但是pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚在囊胚發(fā)育率方面明顯低于體細(xì)胞克隆對照組及pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚胎，有顯著差異(P<0.05)；在囊胚細(xì)胞數(shù)方面，pGCsi-LYAR/RPL31克隆胚的囊胚細(xì)胞數(shù)明顯低于體細(xì)胞克隆組及p