胚胎早期發(fā)育過程中CTB和EVT的基因表達譜研究.pdf

1、目的：本實驗運用不同濃度胰酶消化法分別消化正常妊娠8～12周的人工流產(chǎn)絨毛和蛻膜組織，分離得到純度較高的細胞滋養(yǎng)層細胞(CTB)和絨毛外滋養(yǎng)層細胞(EVT)；利用高通量的基因芯片技術制備CTB和EVT基因表達譜芯片，對比分析獲取差異表達基因。同時，對CTB的標志物HAI-1基因及其表達產(chǎn)物在絨毛組織中的表達規(guī)律進行了初步研究。為探討胚胎早期發(fā)育過程中滋養(yǎng)層細胞侵襲的基因網(wǎng)絡調控機制提供了實驗基礎和理論依據(jù)。 方法：l、收集正常妊

2、娠第8～12周絨毛和蛻膜組織，胰酶消化法分離CTB和EVT，分析細胞純度和活性。 2、提取CTB和EVT的總RNA，檢測RNA純度和完整性。 3、RNA送公司制備基因芯片，并提取基因表達譜數(shù)據(jù)。 4、分析數(shù)據(jù)，獲取差異表達基因。 5、選取兩個差異表達基因MMP-9和TIMP-1，RT-PCR驗證芯片結果可靠性。 6、分析差異表達基因的生物學功能，并對基因進行分類檢索。 7、RT-PCR和免

3、疫組織化學法檢測CTB標志物HAI-1基因和蛋白 在絨毛組織中的動態(tài)表達。 結果：1、運用不同濃度胰酶消化法消化絨毛和蛻膜組織，獲得純度較高的CTB和EVT。 2、RNA純度及完整性分析，A260／280達到1．9～2．1，28SrRNA和18SrRNA電泳條帶清晰，亮度之比約為2：l，表明所抽提的RNA達到實驗要求。 3、建立了CTB和EVT的基因表達譜芯片，質控合格。RT-PCR驗證MMP-9和TIM

4、P-1表達與芯片結果一致，證實芯片結果可信。 4、芯片檢測CTB和EVT基因表達譜，在全基因組54675個基因(或EST)中，共篩選到1318個差異表達基因(或EST)，占約2．4％：聚類分析結果顯示上調基因813個，下調基因505個。所有差異表達基因按GeneOntoloty功能分類標準進行了功能檢索分類。 5、綜合分析不同生物學功能類別的1318個差異表達基因(或EST)，共檢索到細胞外基質相關基因上調29個、下調1

5、1個；信號轉導相關基因上調87個、下調53個；轉錄調節(jié)相關基因上調80個、下調40個；細胞生長／維持相關基因上調41個、下調15個；代謝相關基因上調95個、下調36個；凋亡相關基因上調17個、下調11個；物質轉運相關基因上調104個、下調47個；細胞周期相關基因上調16個、下調7個；應激反應相關基因上調6個、下調0個；細胞防御反應相關基因上調4個、下調5個；免疫應答相關基因上調69個、下調5個；細胞黏附相關基因上調46個、下調28個；發(fā)

6、育相關基因上調58個、下調21個。此外，通過檢索，我們發(fā)現(xiàn)有327個基因尚無功能描述，其中上調195個、下調132個。 6、RT-PCR測得HAI-1基因在絨毛組織中有表達，且其表達量隨妊娠周數(shù)增加而逐漸上調，在妊娠第6周HAI-1基因表達量極低，隨后表達量逐漸升高，至第9周達高峰，且高峰持續(xù)至第10周。免疫組織化學法顯示HAl-1蛋白表達隨妊娠周數(shù)增加呈遞增趨勢，與RT-PCR結果吻合。 結論：1、采用不同濃度胰酶消化

7、、紅細胞裂解和Percoll梯度離心等方法成功分離CTB和EVT，這是對傳統(tǒng)方法的改進，既方便實用，又可以節(jié)約實驗經(jīng)費。 2、建立了CTB和EVT的全基因組表達譜芯片，并獲取差異表達基因，其中某些基因是目前尚未報道生物學功能或在胚胎發(fā)育方面無相關報道的新基因，同時，實驗還印證了當前已經(jīng)報道和胚胎發(fā)育相關的基因。 3、通過綜合分析不同生物學功能類別的差異表達基因的表達變化，提示滋養(yǎng)層細胞侵襲可能存在以下一些調節(jié)機制：細胞黏

8、附和細胞外基質相關基因表達活躍，如MMP-1、MMP-2、MMP-9，ICAM-1等基因上調明顯，表明這些基因參與了EVT識別、黏附、并降解細胞外基質，侵入血管內皮使母體血管重建，從而開啟胎盤的血流供應這一過程；免疫應答和細胞防御反應相關基因表達上調，參與母體對胎兒的免疫“容受性”調節(jié)，使胎兒免受母體的免疫排斥；眾多信號轉導通路和細胞周期調控相關基因發(fā)生改變，總體趨勢是使細胞向增殖期轉變，發(fā)生增殖和分化，有序地形成功能不同的組織和系統(tǒng)，