豬卵核對核移植胚胎發(fā)育及其早期基因表達的影響.pdf

1、目前，哺乳動物體細胞核移植重編程效率仍舊很低，作為治療性克隆的首選動物模型，豬的核移植胚胎干細胞系仍然沒有建立。其技術(shù)瓶頸主要是體細胞核重編程不完全。卵母細胞核作為母源遺傳物質(zhì)，對胚胎發(fā)育甚至體細胞重編程影響巨大。因此，本研究以豬核移植體系為背景，觀察在不去除卵母細胞核的情況下，核移植胚胎的體外發(fā)育情況，結(jié)合高通量測序技術(shù)，研究高效重編程核移植體系特有的基因表達模式，為體細胞核移植重編程機制以及功能性基因的深入研究奠定基礎(chǔ)，以期找到提高

2、體細胞重編程效率的突破點。本研究主要內(nèi)容如下:
　　1、豬卵核對核移植胚胎發(fā)育及體細胞重編程效率的影響
　　首先構(gòu)建豬不去核核移植胚胎，觀察其發(fā)育潛能。我們一共注射了539枚卵丘細胞于完整的卵母細胞內(nèi)，同時注射了461枚卵丘細胞于去核的卵母細胞內(nèi)，兩組重構(gòu)胚分別融合激活后，有260枚多倍體重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚，同時僅有93枚去核重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚，相比去核組，不去核胚胎的卵裂率(81.15％ vs91.05％)、囊胚率(20.15

3、％ vs48.29％)均顯著提高。
　　2、鑒定供體細胞、去核和不去核核移植囊胚染色體數(shù)目
　　對供體細胞、去核核移植囊胚以及不去核核移植囊胚進行染色體制片，染色并統(tǒng)計各細胞染色體數(shù)目，最終確定各細胞染色體數(shù)目正常(38/38/57，正常豬染色體數(shù)目為38條)。
　　3、不去核核移植囊胚在形態(tài)及細胞數(shù)上與去核核移植囊胚、孤雌囊胚的差異
　　以孤雌囊胚為對照，分別對去核、不去核核移植囊胚細胞進行熒光染色計數(shù)，發(fā)現(xiàn)孤

4、雌囊胚平均細胞數(shù)最多(58.60)，去核核移植囊胚平均細胞數(shù)最少(43.30)，不去核核移植囊胚平均細胞數(shù)介于二者之間(56.95)。囊胚形態(tài)上，孤雌囊胚直徑較大，顏色較淺，去核與不去核核移植囊胚直徑較小，顏色較深，且不去核核移植囊胚多為孵化囊胚，呈8字形態(tài)，而去核核移植囊胚多為擴張囊胚，未孵化。
　　4、卵母細胞機械損傷對核移植胚胎發(fā)育的影響
　　考慮到去核過程會對卵母細胞造成機械損傷，因此，本實驗通過對卵母細胞預(yù)先扎孔，

5、并將卵核吸出再注回，模擬去核操作對卵母細胞造成的機械損傷，隨后進行孤雌激活。同時將對照組卵母細胞僅做扎孔處理，不做卵核吸吐動作，模擬不去核核移植胚胎操作，觀察兩種胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)機械損傷導(dǎo)致孤雌胚胎卵裂率、囊胚率降低(卵裂率93.136％ vs95.032％，P≈0.36;囊胚率56.14％ vs64.42％，P≈0.014)，囊胚細胞數(shù)減少(52.65 vs55.40)，但抑制作用不顯著。證明機械損傷這一單方面因素不是造成核移植胚胎

6、發(fā)育能力低下的主要原因。
　　5、染色體加倍對胚胎發(fā)育的影響以及不去核重構(gòu)胚中的卵核能否被體細胞核所取代
　　將不去核重構(gòu)胚模型中的卵核用體細胞核進行置換，再移入另一枚體細胞重新構(gòu)建多倍體胚胎，觀察其發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)體細胞核+體細胞+卵胞質(zhì)胚胎囊胚率僅有10.5％，遠低于卵核+體細胞+卵胞質(zhì)胚胎囊胚率50.6％，說明在不去核重構(gòu)胚模型中，單純性染色體數(shù)目加倍無法促進胚胎發(fā)育，卵母細胞核無法被體細胞核任意取代。
　　6、卵

7、巢類型與卵母細胞發(fā)育潛能的關(guān)系
　　由于卵巢樣品取自市內(nèi)屠宰場，樣品品系不確定，為保證測序樣品間遺傳背景一致，采取單卵巢采卵獨立培養(yǎng)。根據(jù)卵巢表面有無紅體將其分類，分別進行卵子采集、成熟，觀察其發(fā)育潛能，發(fā)現(xiàn)有紅體卵巢采卵效率高，所得卵子成熟率(75.77％ vs68.97％，P＞0.05)、卵裂率(95.33％vs94.00％，P＞0.05)、囊胚率(68.67％vs59.00％，P＞0.05)均高于沒有紅體的卵巢。但差異不顯著

8、，確定可以選擇帶有紅體的卵巢進行采卵，然后構(gòu)建核移植胚胎，用于后續(xù)基因表達圖譜的構(gòu)建實驗。
　　7、構(gòu)建去核、不去核重構(gòu)胚早期基因表達圖譜
　　為探究卵核對體細胞重編程作用的分子機制，了解兩種重構(gòu)胚特有的基因表達模式，本研究采集了去核以及不去核重構(gòu)胚2cell（第一次卵裂）和4cell（發(fā)育阻滯期）時期胚胎進行基因表達譜測序(RNA sequencing)。成功構(gòu)建兩種重構(gòu)胚各自特異基因表達圖譜。發(fā)現(xiàn)去核重構(gòu)胚2cell胚胎

9、有大約28％的基因參與表達，4cell胚胎大約22％的基因參與表達;不去核重構(gòu)胚2cell胚胎有大約30％的基因參與表達，4cell胚胎有大約27％的基因參與表達。
　　8、去核、不去核重構(gòu)胚阻滯前期差異表達基因篩選與分析
　　將去核和不去核重構(gòu)胚相同時期胚胎基因表達圖譜進行比對，發(fā)現(xiàn)2cell階段，不去核重構(gòu)胚相比去核重構(gòu)胚有1738條基因呈現(xiàn)表達上調(diào)，728條基因表達下調(diào)(|log2Ratio|≥5);4cell階段，不

10、去核重構(gòu)胚有2941條基因表達上調(diào)，1682條基因表達下調(diào)(|log2Ratio|≥5);這些差異基因WEGO分析中富集程度最深的基因簇分別集中在綁定調(diào)控、催化和分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性上;其他在不去核重構(gòu)胚中呈現(xiàn)高表達的基因則多數(shù)參與各種代謝過程。其中，Ribosome和Oxidative phosphorylation兩條信號通路在去核重構(gòu)胚發(fā)育趨勢中以及不去核重構(gòu)胚發(fā)育趨勢中反復(fù)出現(xiàn)富集。在4cell阻滯期階段，Proteinprocessi

11、ng in endoplasmic reticulum信號通路顯著富集。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)與細胞核結(jié)構(gòu)緊密相連，并且附著大量核糖體結(jié)構(gòu)，在核移植去核操作過程中可能連同細胞核一起被去除。因此推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工以及核糖體、氧化磷酸化功能的缺失可能是去核重構(gòu)胚較之不去核重構(gòu)胚發(fā)育劣勢的主要原因。
　　9、核定位轉(zhuǎn)錄因子差異表達模式分析
　　去核、不去核重構(gòu)胚差異表達基因中有267條轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)基因在細胞核部位定位表達，其中絕大多數(shù)在去

12、核重構(gòu)胚中表達量微弱，但在不去核重構(gòu)胚中表達顯著上調(diào)。推測這些核定位表達的轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)導(dǎo)致體細胞重編程加快，重編程效果更徹底。
　　10、QRT-PCR基因表達量驗證
　　在RNA-seq差異基因中隨機挑選了6個表達量較高的基因DNMT1、FTL、POLR1D、RPS3、RPS20、BUB3分別進行QRT-PCR檢測。將檢測結(jié)果與RNA-seq結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)，6個基因在兩種檢測方法下表達趨勢基本一致。
　　11、內(nèi)