BGJ398對豬孤雌胚胎發(fā)育及滋養(yǎng)層發(fā)育潛能相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、胚胎由一個全能的受精卵分裂形成多個發(fā)育潛力幾乎相同的卵裂球，隨著胚胎的形態(tài)的不斷變化，形成一個空腔，此時，卵裂球隨之分化形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)，后續(xù)發(fā)育成為胎體和部分胎盤組織，和外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblast，TE)，其后發(fā)育成為胎盤部分。TE在胚胎植入和妊娠維持中起重要作用。
　　前人研究表明抑制水牛早期囊胚內(nèi)FGF信號通路能夠提高囊胚整體的細(xì)胞數(shù)，而且細(xì)胞數(shù)的增加主要來自滋養(yǎng)層。另外在

2、豬的研究也表明，抑制FGF信號通路可以在不影響胚胎正常發(fā)育和相關(guān)多能性基因的表達(dá)的前提下，顯著提高滋養(yǎng)層標(biāo)志基因CDX2的表達(dá)量，然而激活FGF信號通路可以使得CDX2的表達(dá)量明顯下降。雖然機(jī)理暫時不明，但是這有可能成為一個極其有前景的研究方向。目前對豬早期胚胎內(nèi)滋養(yǎng)層的研究甚少，對于在早期胚胎內(nèi)滋養(yǎng)層的發(fā)育情況，并沒有一個衡量其發(fā)育潛力的標(biāo)準(zhǔn)。通常都以滋養(yǎng)層標(biāo)志基因CDX2的表達(dá)量作為滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育情況的標(biāo)準(zhǔn)?；谧甜B(yǎng)層在胚胎在子宮中

3、的定位、附著、侵入過程中的重要地位，建立一個衡量其發(fā)育潛力的標(biāo)準(zhǔn)以及提高其細(xì)胞數(shù)和相關(guān)標(biāo)志/功能基因的表達(dá)，為提高后續(xù)的胚胎移植效率提供了一種非常有實(shí)際意義的探討。
　　本研究主要內(nèi)容如下:
　　對成熟卵細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活(Parthenogenetic activation，PA)后，分別添加濃度為5μM、10μM、15μM、20μM的FGF信號通路抑制劑BGJ-398到基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)168h收集囊胚，與DMSO對照組對比

4、囊胚率、囊胚內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)和相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　1.在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加BGJ398并不影響囊胚的形成和正常發(fā)育，但是與DMSO對照組相比，5μM組囊胚率有顯著提高(29.64％ vs22.97％，P＜0.05)，10μM組囊胚率有一定增長但是差異并不顯著(24.68％vs22.97％，P＞0.05)。當(dāng)濃度增加到15μM、20μM時，囊胚率降低，說明濃度過高對囊胚的形成起到抑制作用。對囊胚進(jìn)行Hoechst染色

5、細(xì)胞手動計(jì)數(shù)，與對照組相比，5μM組囊胚細(xì)胞數(shù)有顯著提高(54.2±7.92 vs45.16±8.75，P＜0.05)，10μM組囊胚細(xì)胞數(shù)有一定增長但是差異并不顯著（45.16±8.75 vs48.2±4.32，P＞0.05），15μM、20μM組囊胚平均細(xì)胞數(shù)均少于對照組。選取最優(yōu)濃度實(shí)驗(yàn)組5μM對囊胚多能性相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明相對于對照組，處理組的多能性相關(guān)基因KLF4的表達(dá)量顯著提高了6.28倍(P＜0.05），而O

6、CT4表達(dá)量為對照組的1.50倍(P＞0.05)，差異不顯著;原始外胚層標(biāo)志基因SOX2的表達(dá)量顯著提高了3.45倍(P＜0.05）;囊胚內(nèi)滋養(yǎng)層標(biāo)志基因CDX2表達(dá)量顯著提高了2.93倍(P＜0.05)。
　　2.BGJ398促進(jìn)以豬PA囊胚滋養(yǎng)層相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)。通過PCR檢測我們發(fā)現(xiàn):GATA3，TEAD4，CDX2，OCT4，TERT，OEMES，F(xiàn)GFR2在囊胚中均有表達(dá)。但是PPARγ，HAND1，MMP2，MMP9

7、以及ELF5，CYP11A1，HSD17B1沒有檢測到表達(dá)。上述結(jié)果提示GATA3，TEAD4，CDX2，OCT4，TERT，OEMES，F(xiàn)GFR2可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中滋養(yǎng)層細(xì)胞檢測的評價基因。選取5μM處理組和有報道過的10μM處理組的囊胚對篩選出的滋養(yǎng)層標(biāo)志物表達(dá)量進(jìn)行定量分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，調(diào)控滋養(yǎng)層形成與分化的CDX2的上游基因GA TA3表達(dá)量在5μM組和10μM組分別提高了1.49倍和2.14倍(P＞0.05)，

8、但差異不顯著;端粒酶活性基因TERT的表達(dá)得到了顯著提高，與對照組相比分別提高了3.03倍和1.70倍(P＜0.05);CDX2上游調(diào)控因子TEAD4表達(dá)量也得到顯著提高，5μM組和10μM組表達(dá)量分別為對照組的2.00倍和2.09倍(P＜0.05);FGFR2由于通路抑制表達(dá)量隨著抑制劑濃度上升而降低;5μM組和10μM組EOMES表達(dá)量分別為對照組的3.18倍(P＜0.05)和1.52倍(P＞0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明BGJ398