丙戊酸對(duì)手工克隆豬胚胎發(fā)育潛能影響的初步研究.pdf

1、手工克隆(Handmade Cloning，HMC)技術(shù)是近年來出現(xiàn)的新技術(shù)，被國(guó)際克隆和胚胎學(xué)領(lǐng)域譽(yù)為“具有劃時(shí)代意義的突破性技術(shù)進(jìn)展”。本研究?jī)?yōu)化了本實(shí)驗(yàn)室HMC豬胚胎的技術(shù)體系，并探討了組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸(valproic acid，VPA)對(duì)手工克隆豬胚胎發(fā)育潛能的影響。取得如下研究結(jié)果:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)室HMC豬胚胎技術(shù)體系的優(yōu)化。(1)探討了用0.4μg/mL脫羰秋水仙堿（decarburization

2、colchicine，DC）處理結(jié)合3.3 mg/mL鏈酶蛋白酶消化后恢復(fù)對(duì)去核效率的影響，其中用DC處理成熟卵母細(xì)胞60 min，鏈酶蛋白酶消化后恢復(fù)25 min，得到最高的整體去核效率76.19％，鏈酶蛋白酶消化后恢復(fù)25 min得到的整體去核效率高于消化后恢復(fù)15 min得到的整體去核效率。(2)探討了粘合方式對(duì)融合效率的影響，去核后半卵的粘合采用卵-卵-供體、卵-供體-卵兩種方式，其中以卵-供體-卵式的粘合方法得到的融合效率最高

3、(87.17％ vs74.40％)。通過體系的優(yōu)化，HMC豬的囊胚率顯著高于優(yōu)化前的囊胚率(36.69％ vs21.15％)。
　　 2.探討了VPA處理來自不同類型供體細(xì)胞的HMC豬胚胎對(duì)其發(fā)育效果的影響。當(dāng)用顆粒細(xì)胞（granular cell，GC）為核移植供體時(shí)，用50 nmol/L的VPA處理HMC豬重構(gòu)胚24 h的囊胚發(fā)育率(48.92％±1.76)極顯著高于對(duì)照組(36.87％±0.74)，25 nmol/L VP

4、A(32.58％±0.96)，75 nmol/L(37.91％±1.24)和100 nmol/L(32.27％±0.67)的重構(gòu)胚(P＜0.01)。當(dāng)用豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblast，PFF)為核移植供體時(shí)，用50 nmol/L VPA和75 nmol/L VPA處理HMC豬重構(gòu)胚24 h的囊胚發(fā)育率分別為52.82％±2.50和51.41％±0.85，顯著高于100 nmol/L VPA處理組的囊胚

5、發(fā)育率（45.43％±2.52，P＜0.05），極顯著高于對(duì)照組(36.69％±0.89)和25 nmol/L VPA處理組(42.95％±2.29)的囊胚發(fā)育率(P＜0.01)。(3)比較了不同濃度VPA處理以轉(zhuǎn)基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞(transgenic porcinefetal fibroblast，Tr-PFF)為供體的HMC豬重構(gòu)胚24 h對(duì)其發(fā)育效果的影響，結(jié)果顯示100 nmol/L VPA和150 nmol/L VPA處

6、理組的囊胚發(fā)育率為42.74％±1.65，38.57％±0.48，極顯著高于0nmol/L，25 nmol/L，50 nmol/L，75 nmol/L VPA處理組的32.39％±1.49，31.02％±1.81，28.69％±1.59，33.57％±1.09(P＜0.01)。
　　 3.探討了VPA處理對(duì)HMC豬重構(gòu)胚組蛋白acH3K14水平的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)一抗acH3K14的最佳免疫熒光染色濃度為1∶100，二抗

7、acH3K14的最佳免疫熒光染色濃度為1∶200。(2)50 nmol/L VPA處理24h組(HMC-V)2-cell及囊胚階段的組蛋白acH3K14水平(1.044±0.023，1.117±0.020)極顯著高于空白組胚胎(HMC)2-cell及囊胚階段的組蛋白acH3K14水平(0.913±0.026，1.079±0.017)(P＜0.01)及孤雌激活組胚胎(PA)2-cell及囊胚階段的組蛋白acH3K14水平(0.97±0.0

8、47，1.026±0.045)(P＜0.01)。VPA處理HMC重構(gòu)胚24h能提高HMC胚胎的組蛋白乙?；健?br>　　 4.探討了VPA處理對(duì)HMC豬重構(gòu)胚的發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明:(1) VPA處理HMC重構(gòu)胚24h，可以提高HMC胚胎的HAT1基因mRNA在1-cell，2-cell及囊胚中的相對(duì)表達(dá)量(3.02±0.04，2.59±0.14，3.83±0.22)，極顯著高于HMC胚胎及PA胚胎在1-cel

9、l，2-cell及囊胚中的相對(duì)表達(dá)量(2.64±0.07，1.63±0.17，2.73±0.18 VS1.00±0.18，1.00±0.26，1.00±0.09)(P＜0.01);極顯著降低HMC-V胚胎的HADC2基因的mRNA在2-cell及囊胚中的相對(duì)表達(dá)量(0.74±0.04，0.58±0.07)(P＜0.01)。(2) VPA處理HMC重構(gòu)胚24h，可以提高HMC胚胎的多能性基因OCT4的mRNA在1-cell，2-cell及

10、囊胚中的相對(duì)表達(dá)量(1.30±0.03，1.58±0.17，1.77±0.07)極顯著高于PA胚胎在1-cell，2-cell及囊胚中的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.01)，與HMC胚胎相比OCT4的mRNA在各階段胚胎的表達(dá)量差異不顯著;對(duì)于NANOG的mRNA的相對(duì)表達(dá)量而言，HMC-V胚胎在1-cell的mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于PA胚胎(0.37±0.06 VS1.00±0.17)(P＜0.01)，而在2-cell及囊胚中的相對(duì)表達(dá)量(2.