表觀遺傳修飾狀態(tài)與豬體細胞核移植胚胎發(fā)育潛能研究.pdf

1、首例體細胞克隆豬已出生十多年，但核移植效率一直很低，困擾著克隆豬的應用。體細胞核移植通常采用分化的體細胞和成熟的卵母細胞，供體細胞和卵母細胞的質(zhì)量直接決定著后期克隆胚胎發(fā)育。目前認為克隆效率低的主要原因是供體細胞核未被完全重編程，主要體現(xiàn)在基因組高甲基化水平。體細胞核移植后細胞核表觀遺傳修飾重建是影響到克隆胚胎能否發(fā)育到期的關(guān)鍵因素，因此通過調(diào)控克隆胚胎的表觀遺傳修飾可能會提高核移植效率。本研究擬通過對胞質(zhì)成熟和供體細胞在豬克隆胚胎中發(fā)

2、揮的作用進行研究，探索胞質(zhì)成熟和供體細胞對核移植胚胎發(fā)育的影響，同時利用表觀修飾藥物和擾低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1探討和闡明表觀遺傳修飾狀態(tài)以及關(guān)鍵基因的表達水平在克隆胚胎重編程過程中的作用，希望為提高豬體細胞核移植效率提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)在卵母細胞體外成熟中，探討了胞質(zhì)成熟對核移植胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明，卵母細胞體外培養(yǎng)33 h即可達到核成熟，之后到42 h之間的時間為胞質(zhì)成熟，胞質(zhì)成熟能夠顯著提高豬克隆

3、胚胎的發(fā)育能力(P<0.05)，這表明充分的胞質(zhì)成熟是核移植胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。
　　 (2)供體細胞狀態(tài)影響著核移植胚胎發(fā)育，對供體細胞種類、性別和甲基化程度進行分析，結(jié)果表明：相對于卵丘細胞和成體成纖維細胞，胎兒成纖維細胞更適合于體細胞核移植；與雄性胎兒成纖維細胞相對，雌性胎兒成纖維細作為供體細胞時核移植胚胎發(fā)育能力差異不顯著，而雌性胎兒成纖維細更適合于X染色體失活的機理研究；5-aza-dC或5-methyl-dC能夠顯著降低

4、或提高胎兒成纖維細胞的甲基化水平(P<0.05)，但并不利于核移植效率的提高。這表明雌性胎兒成纖維細胞更適合作為體細胞核移植的供體細胞，而改變其甲基化水平不利于體細胞重編程。
　　 (3)利用5-aza-dC對供體細胞和核移植胚胎進行處理，分析了處理后對細胞增殖、胚胎發(fā)育、核重塑及基因表達等的影響，結(jié)果表明：5-aza-dC對供體細胞增殖具有抑制作用，能夠顯著降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和3a和提高Igf2和Xist在供體細胞中的表達

5、水平(P<0.05)，處理供體細胞后不利于核移植胚胎的發(fā)育(主要表現(xiàn)為核重塑能力差、胚胎卵裂率低以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和多能性基因表達水平未得到改善)；5-aza-dC處理核移植胚胎能夠顯著增強胚胎發(fā)育能力(P<0.05)，其中25 nmol處理24 h效果最佳，5-aza-dC處理核移植胚胎后顯著加快了供體細胞核基因的重編程，促進了類原核形成和早期卵裂，改善了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因、印記基因、多能性基因以及去甲基化相關(guān)基因的表達水平，

6、使其接近于體外受精胚胎表達模式；5-aza-dC同時處理供體細胞和核移植胚胎，發(fā)育能力得到更顯著的提高(P<0.05)，這可能是雙重處理更有利于供體核的重編程。
　　 (4)利用TSA對核移植胚胎進行處理，觀察了處理后體內(nèi)外克隆胚胎的發(fā)育能力，同時對TSA處理期間基因表達的變化進行了分析，結(jié)果表明：TSA能夠顯著增加核移植胚胎的體外發(fā)育率；進行胚胎移植后，相對于正常核移植胚胎，處理組提高了克隆胚胎妊娠率和出生率，并能有效的防止大

7、舌頭病和死胎的發(fā)生；TSA處理后顯著加快了供體細胞核基因的重編程和改善了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(P<0.05)。這表明TSA處理能夠增強供體核的重塑和糾正胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達，從而增強體內(nèi)外胚胎發(fā)育能力。
　　 (5)利用RNAi擾低Dnmt1或許能夠改善DNA的去甲基化從而提高核移植胚胎的發(fā)育能力，對RNAi體系、Dnmt1擾低后的卵母細胞成熟和核移植胚胎發(fā)育能力進行了分析，結(jié)果表明，壁顆粒細胞共培養(yǎng)可以增強裸卵成熟質(zhì)量