豬體細胞核移植相關(guān)技術(shù)研究.pdf

1、1．探討了豬卵母細胞體外成熟過程中減數(shù)分裂進程和卵母細胞的發(fā)育潛力。(1)不同直徑卵泡內(nèi)的卵母細胞的成熟進程及各時相出現(xiàn)的時間存在差異。直徑>2mm的卵泡內(nèi)的卵母細胞體外培養(yǎng)16 h，大部分發(fā)生GVBD(germinal vesicle breakdown)；卵母細胞GV期的比率由0h的68.00％下降到16h的15.38％；成熟培養(yǎng)20h時，終變期(diakinesis，DK)的比率達到峰值(27.06％)，而M I的峰值(69.69

2、％)出現(xiàn)在培養(yǎng)后28h；成熟培養(yǎng)32～44h時，Ana-I /Tel-I期的比率達到最高(53.33％)：成熟培養(yǎng)48h時，MⅡ期的比率達到最大值(63.64％)。(2)不同直徑卵泡的卵母細胞體外成熟后的孤雌發(fā)育能力不同。直徑<2mm、直徑2～6mm、直徑>6mm的卵泡的卵母細胞的成熟率分別為5.12％，66.63％和46.72％；分裂率分別為1.42％，72.19％和58.54‰囊胚率分別為0、28.76％和23.13％。直徑<2mm

3、和>6mm卵泡內(nèi)的卵母細胞的卵裂率明顯低于直徑2～6mm卵泡的卵母細胞的卵裂率(P<0.05)。直徑2～6mm卵泡內(nèi)的卵母細胞體外成熟較快，體外發(fā)育潛能較高。 2．探討了激素和生長因子對豬卵母細胞體外成熟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母細胞成熟率顯著高于添加0.01IU/mL人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG)的卵母細胞成熟率(P<0.05)，但兩組間的分裂率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。豬卵母細胞分

4、別在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生長因子(EGF)的成熟液中成熟培養(yǎng)后進行孤雌激活，50ng/mL EGF組的成熟率達到66.89％，孤雌激活的分裂率達到84.90％，囊胚率達到30.20％，成熟率顯著高于其余各組，分裂率和囊胚率高于對照組。在成熟液中添加10ng/mL胰島素樣生長因子(IGF-I)顯著提高豬卵母細胞的第一極體排出率。在成熟液中同時添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I顯著提高豬卵

5、母細胞的孤雌發(fā)育能力(P<0.05)。分別使用以TCM-199、NCSU-23(North Carolina State University-23，北卡大學胚胎培養(yǎng)液)和PZM-3為基礎液的成熟液進行成熟培養(yǎng)豬卵母細胞，各組間在分裂率，成熟率和囊胚率方面差異不顯著(P>0.05)，表明均可用于豬卵母細胞的體外成熟和體外培養(yǎng)。 3．系統(tǒng)探討了孤雌激活方法對豬卵母細胞孤雌發(fā)育效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)濃度為9％的乙醇(EH)激活

6、處理10min效果好于15min；(2)用9％EH激活處理10min后，再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培養(yǎng)處理3～4h的卵母細胞分裂率及囊胚率分別為82.86％和22.86％，顯著高于再用10μg/mL放線菌酮(CHX)+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2+2μmol/L 6-DMAP、10μg/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10 pg/mL CHX+2μmol/L6-

7、DMAP+10 mmol/LSr2+培養(yǎng)處理3～4h的卵母細胞。(3)比較幾種激活方法(5μmol/L Ion激活處理5min，9％乙醇激活處理10min，50 v/mm和50μs的電脈沖2次)的豬卵母細胞孤雌激活效果發(fā)現(xiàn)，離子霉素(Ion)的豬卵母細胞孤雌激活效果最好，囊胚率達到37.50％。(4)卵母細胞周圍的卵丘細胞層數(shù)對其成熟后的孤雌發(fā)育有顯著影響，4～6層和6層以上卵丘-卵母細胞復合體成熟后的孤雌激活分裂率(68.99％和75

8、.36％)和囊胚率(32.56％和37.68％)顯著高于其它組(p<0.05)。 4．對豬卵丘細胞、胎兒成纖維細胞和睪丸間質(zhì)細胞的分離和傳代培養(yǎng)進行了系統(tǒng)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬卵丘細胞單層的生長需要5～6d；運用組織塊法和酶消化法獲得胎兒成纖維細胞單層的生長時間分別為10～11d和8～9d。酶消化法和鋼網(wǎng)過濾篩選法可獲得豬睪丸間質(zhì)細胞，豬睪丸間質(zhì)細胞單層生長需要3～5d。豬胎兒成纖維細胞冷凍解凍后，復蘇率為68.36％。通過培養(yǎng)和觀

9、察，豬胎兒成纖維細胞的生長形成有規(guī)則的生長曲線。 5．對豬體細胞核移植的方法及影響因素進行了探索。(1)豬卵母細胞體外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后，分別進行去核構(gòu)建重構(gòu)胚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟44h和48h的卵母細胞核移植后的融合率(58.99％和56.51％)、卵裂率(67.52％和65.73％)和囊胚率(22.78％和15.96％)較高，其中卵齡為44h的分裂率與囊胚率顯著高于卵齡為40h、

10、36h、32h、28h的卵母細胞(P<0.05)。卵齡為48h的融合率高于卵齡為52h的卵母細胞(P<0.05)。(2)盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系統(tǒng)去核法的去核率分別為76.33％，100.00％，98.40％，前者低于后兩者(P<0.05)；三種去核方法去核的卵母細胞核移植后，分裂率以Hoechest染色法較低(P<0.05)，但融合率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。(3)不同注核方法(細

11、胞質(zhì)內(nèi)注射法和透明帶下注射法)的核移植效果研究結(jié)果顯示，細胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射法的分裂率為(68.13％和60.37％)與囊胚率(6.44％和8.08％)差異均不顯著(P>0.05)。 6．探討了供體細胞種類及其培養(yǎng)處理方法對豬體細胞核移植效果的影響。(1)比較胎兒成纖維細胞、顆粒細胞和卵丘細胞的核移植效果發(fā)現(xiàn)，胎兒成纖維細胞的融合率(64.74％)高于顆粒細胞(51.05％)和卵丘細胞(56.89％)，但三種細胞的卵裂率及

12、囊胚率差異不顯著(P>0.05)。(2)不同代數(shù)的胎兒成纖維細胞的核移植效果的研究發(fā)現(xiàn)，6～9代的融合率顯著高于3～5代和>10代的成纖維細胞(P<0.05)，但卵裂率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。(3)不同性別豬胎兒成纖維細胞核移植效果的研究發(fā)現(xiàn)：雄性胎兒成纖維細胞核移植的融合率和分裂率與雌性胎兒成纖維細胞相比差異不顯著(P>0.05)，但囊胚率顯著低于雌性胎兒成纖維細胞(P<0.05)。(4)100％長滿匯合的胎兒成纖維細胞的

13、核移植融合率高于70～80％匯合的胎兒成纖維細胞(P<0.05)，分裂率高于血清饑餓培養(yǎng)的胎兒成纖維細胞(P<0.05)，但囊胚率差異不顯著。(5)豬胎兒成纖維細胞冷凍解凍后的核移植分裂率和囊胚率均顯著低于新鮮和4℃冷藏的細胞(P<0.05)，雖然融合率無顯著差異(P>0.05)，表明豬胎兒成纖維細胞解凍后不宜直接進行核移植。(6)表面光滑的豬卵丘細胞做供體細胞的核移植后的分裂率和囊胚率均顯著高于表面粗糙的豬卵丘細胞做供體細胞的核移植后