馬體細胞核移植的研究.pdf

1、體細胞核移植技術(shù)為家畜快速繁育和基因組保存提供了新的機遇和方法。在我國，這項技術(shù)在牛羊等家畜的繁育上已得到應(yīng)用，但在馬的繁殖上還很少開展這方面的研究。本研究以純血馬的體細胞為供核細胞，分別以馬和驢的卵母細胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建同種和異種體細胞核移植胚，建立了馬的體細胞培養(yǎng)體系及馬和驢卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)體系，并對胚胎的體外培養(yǎng)、手術(shù)法移植早期異構(gòu)克隆胚到受體馬輸卵管進行了相關(guān)的研究。
　　1．馬體細胞系的建立
　　本研究通過對馬

2、腿部皮膚組織的體外培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇的實驗研究，建立了馬成纖維細胞的培養(yǎng)和保存體系。
　　2．馬體細胞核移植胚的構(gòu)建
　　通過對馬卵母細胞兩種采集方法的對比，發(fā)現(xiàn)切割法比抽吸法更適合馬卵母細胞的收集，可獲得較高的回收效率。以M199和DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)液用于馬卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)，結(jié)果顯示成熟率差異不顯著。擴展型(Ex) COCs體外培養(yǎng)24-28小時和緊湊型(Cp) COCs體外培養(yǎng)30-36小時后成熟率分別達到6

3、5.2％和42.9%，兩種類型COCs成熟后的MⅡ期卵母細胞且具有相同的發(fā)育能力。馬體細胞核移植實驗中發(fā)現(xiàn)140V，20Us,2次脈沖的條件可獲得較高的融合效率，融合率達72.5%。采用Ionomycin與6-DMAP和CHX聯(lián)合激活，重構(gòu)配的卵裂率為41.9%。
　　3．馬-驢異種核移植胚的構(gòu)建
　　本實驗分別采用M199培養(yǎng)液，DMEM/F12培養(yǎng)液和由M199培養(yǎng)液與DMEM/F12培養(yǎng)液按1：1混合組成的培養(yǎng)液作為驢

4、卵母細胞的體外成熟基礎(chǔ)培養(yǎng)液，最終成熟率差異不顯著（p>0.05），并且這三種成熟液驢卵母細胞的孤雌激活和發(fā)育無顯著影響。提高成熟液中鈣離子的濃度不能有效提高驢卵母細胞體外成熟和孤雌激活的效率。驢的COCs同馬的COCs相似也分為擴展型(Ex) COCs和緊湊型(Cp) COCs，兩種類型的COCs分別成熟培養(yǎng)30-36小時和24-28小時后獲得MⅡ期卵母細胞的效率分別為75.9%和55.2%。驢卵母細胞在室溫下放置于EH培養(yǎng)液中12小

5、時內(nèi)對卵母細胞的體外成熟率無顯著影響。長時間(20-22小時)的運輸卵巢、卵母細胞或是使用簡易便攜式培養(yǎng)系統(tǒng)在運輸途中成熟培養(yǎng)驢卵母細胞都不利于卵母細胞的成熟，但后兩種方法的成熟效率高于前一種方法。SOFaa和DMEM/F12都可用于驢的胚胎體外培養(yǎng)，差異不顯著(p>0.05)。提高發(fā)育液中葡萄糖的濃度可促進胚胎的發(fā)育，但差異不顯著。以馬皮膚成纖維細胞和去核的驢卵母細胞胞質(zhì)體構(gòu)建馬-驢異種核移植胚胎，在融合參數(shù)為130-150V,20U