兔子體外成熟卵母細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植的研究.pdf

1、隨著越來越多的物種被成功克隆，哺乳動物核移植技術(shù)越來越受到人們的重視。在基礎(chǔ)理論研究方面，它可用于研究細(xì)胞發(fā)育過程中基因的表達(dá)規(guī)律和調(diào)控機(jī)理，亦可用于建立穩(wěn)定的動物模型，利于研究人類疾病的發(fā)病機(jī)理；在生產(chǎn)實踐中，它可用于畜牧業(yè)育種、生產(chǎn)可表達(dá)特殊醫(yī)藥蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，還可用于延緩珍稀瀕危動物的滅絕。 哺乳動物核移植需要使用大量的卵母細(xì)胞做為受核胞質(zhì)，而從動物體內(nèi)直接獲取卵母細(xì)胞不僅難度大、效率低，價格也不菲。從屠宰場廢棄卵巢上回

2、收卵母細(xì)胞，數(shù)量大，價格低，是我們研究哺乳動物核移植的很好來源。在多種動物上，利用屠宰場回收的未成熟卵，經(jīng)體外培養(yǎng)成熟后，可用于核移植并出生克隆后代，但在兔子上一直沒有成功。 雖然早在1975年就開始兔子胚胎細(xì)胞核移植的研究并獲得囊胚，但兔子核移植的研究并不順利。1988年Stice等人用8細(xì)胞胚胎卵裂球做供核細(xì)胞，首次出生了6只胚胎細(xì)胞核移植克隆兔；直到2002年Chesne等人利用卵丘細(xì)胞為供核細(xì)胞，才首次成功出生了體細(xì)胞克

3、隆兔。兔子之所以如此難以克隆，跟它自身的生理特點有很大關(guān)系。目前成功出生的克隆兔子，使用的受核胞質(zhì)仍然全部來自于體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞。為了使用更豐富且廉價的卵母細(xì)胞來研究兔子克隆的難點，有必要盡快開展體外成熟卵母細(xì)胞用于核移植的研究。本論文詳細(xì)研究了兔子體外成熟卵母細(xì)胞用于核移植的方案。 首先我們建立了兔子卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng)。從屠宰場取回卵巢上回收的未成熟卵母細(xì)胞，其質(zhì)量是不一樣的。在本實驗中，我們比較了不同卵泡內(nèi)回收卵母細(xì)胞的直

4、徑、成熟進(jìn)程和發(fā)育能力。我們依直徑將卵泡分為4組：(1)<0.5mm；(2)0.7-1.0mm；(3)1.0-1.5mm；(4)>1.5mm。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同卵泡直徑內(nèi)的卵母細(xì)胞直徑不同，隨著卵泡直徑逐漸增大，卵母細(xì)胞直徑也逐漸增大。直到卵泡直徑達(dá)到1mm以上時，卵母細(xì)胞直徑長足，達(dá)到113μm左右。研究GV染色質(zhì)構(gòu)型時發(fā)現(xiàn)，0.7-1.0mm卵泡卵母細(xì)胞LC構(gòu)型比例達(dá)75％，但>1.0mm卵泡卵母細(xì)胞則70％處于TC構(gòu)型。采用M199

5、做為卵母細(xì)胞成熟液，獲得體外成熟的卵母細(xì)胞。不同直徑卵泡來源的卵母細(xì)胞，其成熟能力和成熟速度略有差異。<0.5mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞無法恢復(fù)減數(shù)分裂，0.7-1.0mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，雖然完全具有了成熟能力，但成熟速度較慢，發(fā)育能力較差。>1mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，已經(jīng)完全具備了胚胎早期發(fā)育的能力，體外培養(yǎng)10個小時即可達(dá)到最大成熟率96.6±1.7％，孤雌激活后，第六天囊胚率可達(dá)55.1±3.2％。 目前出生克隆兔子的研究，都采

6、用電激活的方式激活重構(gòu)胚。本實驗采用化學(xué)激活的方法，用Ionomycine引發(fā)鈣波動，并用6-DMAP和CHX抑制MPF/CSF活性。優(yōu)化條件后，我們得出如下最佳方案：2.5μg/ml的Ionomycine處理5min，2mM的6-DMAP加5μg/ml的CHX聯(lián)合作用1小時，隨后換入含10％FCS的M199中培養(yǎng)。>1mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞孤雌激活并體外培養(yǎng)12小時后觀察，卵裂率可達(dá)81.9±5.0％，6天后觀察，囊胚率可達(dá)55.1±3

7、.2％，囊胚孵出率可達(dá)60.0±5.8％。 成熟卵母細(xì)胞去核的成敗，直接影響胚胎后期能否正常發(fā)育。本實驗用Demecolcine誘導(dǎo)胞質(zhì)突起，然后在顯微操作儀下，用去核針吸去突起和第一極體，去核率可達(dá)100％。低濃度的Oemecolcine毒性較小，采用此方法去核的重構(gòu)胚，經(jīng)移植后，可成功獲得克隆后代。我們的研究發(fā)現(xiàn)，卵齡年輕的卵母細(xì)胞不容易被誘導(dǎo)出胞質(zhì)突起。同樣用0.6μg/ml的Demecolcine誘導(dǎo)60分鐘，IVM12

8、小時的卵母細(xì)胞只有32.7％形成胞質(zhì)突起，IVM14小時的卵母細(xì)胞可以達(dá)到86.8％，而IVM18小時的卵母細(xì)胞，突起率可達(dá)90.3％。對于IVM14小時的卵母細(xì)胞來說，約有80％的極體與核偏移在10°以內(nèi)，尚可用盲吸去核；對于IVM18小時的卵母細(xì)胞來說，只有65％的極體與核偏移在30°以內(nèi)了，用盲吸去核的方法已經(jīng)很難保證去核率了。因此更有必要使用Demecolcine輔助去核。 供核細(xì)胞所處的細(xì)胞周期，關(guān)系到供體核進(jìn)入受核胞

9、質(zhì)后重編程的效果。目前普遍的做法是將G0/G1期的供體核移入MII期的受核胞質(zhì)中。我們采取了接觸抑制和血清饑餓這兩種方法來同步化供核細(xì)胞到G0/G1期。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，接觸抑制3-5天的處理可以使80％的細(xì)胞處于G0/G1期，血清饑餓3-5天則可以達(dá)到85％以上。 受核胞質(zhì)的卵齡也是影響核移植成功率的一個重要因素，我們的研究表明，IVM12小時的成熟卵母細(xì)胞就可以用作核移植，直到IVM18小時，卵母細(xì)胞的質(zhì)量沒有明顯下降，均可

10、支持重構(gòu)胚卵裂率達(dá)到80％左右，囊胚率達(dá)到30％左右。添加MG132并沒有提高囊胚率，反而使囊胚率由26.6％降低到9.2％。但添加MG132后對卵裂影響有限，雖然數(shù)值有所降低，但差異并不顯著。 不同類型的細(xì)胞分化程度不同，不同類型的供核細(xì)胞克隆效率也是不同的。我們總共采用了3種細(xì)胞做為供核細(xì)胞。當(dāng)用耳朵皮膚成纖維細(xì)胞作供核細(xì)胞時，卵裂率只有78％，囊胚率只有19.7％。采用胎兒皮膚成纖維細(xì)胞和卵丘細(xì)胞做為供核細(xì)胞時，卵裂率沒有