牛卵泡卵母細(xì)胞體外成熟與核移植電融合參數(shù)的優(yōu)化.pdf

1、本試驗(yàn)在體外成熟培養(yǎng)液中添加EGF和IGF-Ⅰ，研究其對(duì)牛卵母細(xì)胞核及胞質(zhì)成熟的作用，并通過(guò)孤雌激活來(lái)檢測(cè)EGF和IGF-Ⅰ對(duì)牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的影響；同時(shí)以牛乳腺上皮細(xì)胞為核供體，以牛MⅡ期卵母細(xì)胞為核受體，以電融合法構(gòu)建重構(gòu)胚，通過(guò)比較不同的電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)長(zhǎng)、供體細(xì)胞的不同處理方式以及不同的融合液組成等，系統(tǒng)的研究了不同因素對(duì)重構(gòu)胚融合效率的影響，旨在優(yōu)化融合程序，提高重構(gòu)胚的電融合率和重構(gòu)胚的發(fā)育率。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.

2、在成熟培養(yǎng)液中分別添加0，10，50，100ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，24h檢查成熟率，在含5μmol/L離子霉素的CR1aa培養(yǎng)液中處理5min，然后在含2mmol/L6-DMAP的CR1aa培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h，用CR1aa培養(yǎng)液洗三次后進(jìn)行分組培養(yǎng)，48h檢查卵裂率，7～8天檢查囊胚發(fā)育率。結(jié)果表明，添加EGF能夠提高卵母細(xì)胞的體外成熟，促進(jìn)孤雌激活胚卵裂率和囊胚發(fā)育率，以添加50ng/mL時(shí)的成熟率、卵裂率和囊胚發(fā)育率最高

3、，分別為78.28％、86.50％、24.81％同對(duì)照組(65.05％、73.68％、10.20％)相比差異顯著(P＜0.05)，表明添加50ng/mL的EGF，無(wú)論是對(duì)卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)，還是對(duì)孤雌胚卵裂率和囊胚發(fā)育率都可以得到理想的效果。 2.在成熟培養(yǎng)液中分別加入0，10，50，100ng/mL的胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，觀察成熟率、孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。添加IGF-Ⅰ能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟，提高孤雌胚

4、的卵裂率和囊胚發(fā)育率，以添加100ng/mL時(shí)的成熟率、卵裂率和囊胚發(fā)育率最高，分別為76.67％、83.85％、20.74％同對(duì)照組(65.05％、73.68％、10.20％)相比差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明添加100ng/mL的IGF-Ⅰ能夠促進(jìn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟，同時(shí)也能夠提高孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。 3.在體外成熟過(guò)程中分別加入50ng/mLEGF，100ng/mLIGF-Ⅰ或者50ng/mLEGF/100n

5、g/mLIGF-Ⅰ，觀察成熟率、孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。EGF/IGF-Ⅰ能夠促進(jìn)卵裂率和囊胚發(fā)育率，分別為86.15％、87.05％、28.21％，同對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)，同單獨(dú)添加EGF和IGF-Ⅰ組相比差異不顯著(P＞0.05)，表明EGF/IGF-Ⅰ能夠促進(jìn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟，提高孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。 4.用不同電場(chǎng)強(qiáng)度2.0、2.4、2.8kv/cm，其他參數(shù)為20μs，2次脈沖，10ms

6、不變的情況下，觀察電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)重構(gòu)胚融合率及早期發(fā)育的影響。結(jié)果表明，不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)融合率的影響顯著(P＜0.05)，以2.4kv/cm融合效率(55.77％)最好。 5.用不同脈沖時(shí)長(zhǎng)10μs、20μs、30μs，其它參數(shù)2.4kv/cm，2次脈沖，10ms不變的情況下，觀察其對(duì)重構(gòu)胚融合率及早期發(fā)育的影響。結(jié)果表明，不同脈沖時(shí)長(zhǎng)對(duì)融合率的影響顯著(P＜0.05)，以20μs融合效率最好。 6.在液氮(-196℃)冷凍保

7、存細(xì)胞解凍后直接用做核供體細(xì)胞以及未經(jīng)冷凍保存過(guò)的新鮮細(xì)胞直接用于核供體，觀察對(duì)融合率的影響及重構(gòu)胚早期發(fā)育的影響，核供體細(xì)胞經(jīng)冷凍保存解凍后直接用于核移植，同新鮮對(duì)照細(xì)胞相比，對(duì)電融合率及早期發(fā)育沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。 7.分別用D-山梨醇和D-甘露醇電融合液，研究其對(duì)電融合及核移植胚早期發(fā)育的影響，其融合率分別為59.22、56.36％，不同電融合液組成對(duì)電融合率影響差異不顯著(P＞0.05)，但山梨醇融合液融合率略