兔卵母細(xì)胞為受體的同種和異種體細(xì)胞核移植研究.pdf

1、本研究的主要目的是通過建立體細(xì)胞核移植(SENT)方法，在體外條件下獲得兔一兔同種或人一兔異種克隆囊胚，為以后從克隆囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離培養(yǎng)出全能性的胚胎干細(xì)胞并用于治療性克隆等研究提供實驗依據(jù)和方法。本研究從重構(gòu)胚的激活、受體卵母細(xì)胞的來源、克隆胚胎的體外培養(yǎng)及兔卵丘細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(rBMSCs)用作核供體等幾個方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究以提高SCNT的效率。此外，利用人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs)用作核供體進(jìn)行了人—兔異種克隆的初步

2、探索并獲得了異種克隆囊胚。主要內(nèi)容如下： 為了提高兔體細(xì)胞核移植(SCNT)胚胎的體外發(fā)育效果，通過不同激活劑采用不同聯(lián)合處理對兔SCNT的重構(gòu)胚進(jìn)行激活，以遴選出適合于本實驗室條件下較為理想的激活方案，結(jié)果表明：兔SCNT重構(gòu)胚先用5 μM ION避光處理4min，洗滌后再移入含2mM 6-DMAP和7.5μg/ml CB的mM-199(添加有10％FBS的TCM-199)中培養(yǎng)3h的激活效果較為理想，獲得了73.3％的分裂率

3、以及22.2％的囊胚率。雖然采用的激活方法與胚胎體外培養(yǎng)液各不相同，但改進(jìn)的激活方法獲得的實驗結(jié)果達(dá)到國內(nèi)外已有兔SCNT報道的相同水平。 為了降低實驗成本，獲取更多的卵母細(xì)胞州丁SCNT，本研究國內(nèi)外首次采用抽吸自PMSG或FSH超排母兔排卵結(jié)束(HCG注射14h)后卵巢表面殘留卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞用于SCNT研究，并同時與排出到輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果表明：PMSG和FSH超排獲得的抽吸組成熟卵母細(xì)胞(以可見第一極體為準(zhǔn)

4、)的比率分別極顯著和顯著低于各自的排出組(PMSG：70.7％vs94.6％，P<0.01；FSH：81.5％vs 94.6％，P<0.05)，且PMSG和FSH抽吸組問卵母細(xì)胞的成熟率差異顯著(70.7％vs 81.5％，P<0.05)。PMSG和HCG超排的抽吸組成熟卵母細(xì)胞的去核效率也顯著低于各自的排出組(PMSG：抽吸vs排出=69.2％vs 83.6％，P<0.05；FSH：抽吸vs排出=71.6％vs81.0％，P<0.05

5、)。抽吸組成熟卵母細(xì)胞的注核效率以及此類卵母細(xì)胞用作胞質(zhì)受體經(jīng)體細(xì)胞移植后的重構(gòu)胚在融合率、分裂率以及分裂胚胎發(fā)育至囊胚的比例與排出組差異均不顯著(JP>0.05)。但是，PMSG超排后的抽吸組成熟卵母細(xì)胞體細(xì)胞核移植的總體效率顯著低于其排出組(8.4％vs11.5％，P<0.05)，而FSH超排的結(jié)果抽吸組與排出組差異則不顯著(10.2％vs 11.6％，P>O.05)。結(jié)果顯示：抽吸白超排兔卵巢表面卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞人多數(shù)都已經(jīng)成熟，

6、獲得的重構(gòu)胚與源自排出劍輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞的重構(gòu)胚具有等同的發(fā)育能力，可以不經(jīng)體外成熟培養(yǎng)而直接用于體細(xì)胞核移植，而且FSH超排獲得的抽吸組卵母細(xì)胞體細(xì)胞核移植的總體效率與排出到輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞沒有顯著差別。 為了提高兔SCNT胚胎體外發(fā)育至囊胚階段的比例，首次在體外培養(yǎng)階段添加不同濃度(O、10和20gM)的β-巰基乙醇(β-ME)米檢測β-ME的添加對兔孤雌生殖和體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育能力和囊胚質(zhì)量的影響。結(jié)果顯示：在m

7、M-199添加10μM β-ME后顯著提高了孤雌生殖和SCNT胚胎的分裂率以及胚胎各階段的發(fā)育能力(p<0.05)。通過對孤雌生殖胚胎首先在10uM的B．ME中培養(yǎng)12小時后，分裂的2～4細(xì)胞胚胎再分別用添加0、10、20gM的β-ME體外培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，β-ME的這種促進(jìn)作用主要在胚胎開始培養(yǎng)的前12h內(nèi)(≤4細(xì)胞階段)起作本研究選擇具有臨床應(yīng)用價值的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)為核供體進(jìn)行核移植，建立了兔SCNT的方法

8、，重構(gòu)胚的分裂率為65.2％，分裂后胚胎發(fā)育至囊胚階段的比例為26.7％，獲得的囊胚有62.5％進(jìn)入孵化階段；孵化出來的細(xì)胞貼壁生長并向周圍擴(kuò)展，顯示了具有向下一階段發(fā)育的潛能。實驗結(jié)果表明以兔成體體細(xì)胞的骨髓基質(zhì)細(xì)胞為核供體，經(jīng)克隆技術(shù)生產(chǎn)出囊胚并從中分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞具有可行性，為進(jìn)一步從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞中分離并培養(yǎng)出胚胎干細(xì)胞提供了克隆源性的囊胚。 在已經(jīng)建立的兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(rBMSCs)核移植方法的基礎(chǔ)上，首次探討了利用

9、人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs)構(gòu)建人—兔異種克隆胚胎的方法，并通過用rBMSCs和兔卵丘細(xì)胞用(rCCs)做核供體的同種克隆進(jìn)行比較，米評估hBMSCs用作核供體的克隆效率。結(jié)果顯示，與用于同種克隆的融合電壓(2.0k V/cm)相比，人—兔異種克隆重構(gòu)胚的融合率很低，但可以通過提高的融合電壓強度(2．4kV/cm)極顯著提高h(yuǎn)BMSCs—兔異種克隆重構(gòu)胚的融合率(60.0％vs 39.6％，P

10、重構(gòu)胚相一致的融合率(60.0％vs 62.2％，P>0.05)，而改進(jìn)的直接注核法也可以提高顯微操作的總體效率(78.4％vs 68.9％，P<0.05)以獲得更多的重構(gòu)胚。雖然，由hBMSC重構(gòu)的人—異種克隆胚胎發(fā)育至囊胚的比例極顯著低于由rCCs和rBMSCs構(gòu)建的同種克隆囊胚，但依舊有少量重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚階段(4.8％～6.1％vs 27.3％和21.4％，P<0.01)。實驗結(jié)果表明，以人骨髓基質(zhì)細(xì)胞為核供體，經(jīng)異種克隆技術(shù)可