人合子原核構(gòu)型及早期卵裂與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

1、<p>　　人合子原核構(gòu)型及早期卵裂與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系</p><p>　　作者：李瑞文 滕文頂 鮮紅 周瑞年</p><p>　　【摘要】 目的:探討胚胎早期卵裂及原核構(gòu)型能否指導(dǎo)移植胚胎的選擇及與胚胎發(fā)育潛力之間的關(guān)系。方法:根據(jù)早期卵裂時(shí)間及原核構(gòu)型不同進(jìn)行篩選而移植的129個(gè)體外受精(IVF)、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)周期，共1 032個(gè)正常受精卵為資料。根據(jù)受

2、精卵原核構(gòu)型的不同分為四組，結(jié)合構(gòu)型類型及早期卵裂與否進(jìn)行選擇性移植，通過觀察優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、種植率和懷孕率，來評估合子原核構(gòu)型和早期卵裂與胚胎發(fā)育潛力的關(guān)系。結(jié)果:最常見的原核構(gòu)型為PN1(29.58%)及PN2(27.67%)，接著是PN3(22.38%)和PN4(20.37%)，而且這些構(gòu)型與受精方式及精子穿卵的位點(diǎn)無關(guān);與其它種類的原核構(gòu)型相比，源于PN1和PN4原核構(gòu)型的合子發(fā)育到優(yōu)質(zhì)胚胎及囊胚的比例顯著增高(P&am

3、p;lt;0.05);PN1和PN4原核構(gòu)型的合子發(fā)育成的胚胎，其種植率和懷孕率亦顯著升高(P&lt;0.05);早期卵裂胚胎與晚卵裂胚胎相比，發(fā)育到優(yōu)質(zhì)胚及囊胚的胚胎數(shù)與種植率、懷孕率均顯著增高(P&lt;0.05)。結(jié)論:合子原核構(gòu)型與胚胎早期卵裂時(shí)間能夠指導(dǎo)移植胚胎的選擇，對種植率及懷孕率的提高有一定的臨床意義。</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 人;合子;原核構(gòu)型;早期卵裂;胚胎發(fā)育<

4、;/p><p>　　【ABSTRACT】 Objective:To evaluate the relationship between embryo early cleavage,pronuclei orientation and embryo development potential,and investigate whether it is useful to select the embryo that wi

5、ll be transfered.Methods:In this retrospective study,a total of 1 032 normal zygotes(two pronuclei)from 129 treatment cycles with IVF/ICSI were analyzed.These zygotes were divided into four groups according to the differ

6、ent zygote pronuclei orientation and the developmental potential.Early cleavage </p><p>　　【KEY WORDS】 Persons,Zygote,Pronuclear orientation,Early cleavage,Embryonic development</p><p>　　體外受精(in

7、vitro fertilization，IVF)及胚胎移植(embryo transfer，ET)是目前治療不孕癥的主要手段。影響IVFET成功率的因素很多，胚胎質(zhì)量是最重要的因素之一。任何一個(gè)IVF，其最終目的就是要達(dá)到一個(gè)較高的種植懷孕率及獲嬰率，同時(shí)盡量避免多胎的發(fā)生。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，一個(gè)好的選擇胚胎的標(biāo)準(zhǔn)變得越來越需要，特別是在一個(gè)移植周期，當(dāng)有三個(gè)以上的一級胚胎可供移植選擇時(shí)，這種需要變得更加迫切。解決這一問題的方法就是尋

8、找更多有一定預(yù)示作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)，使其能夠指導(dǎo)以后的胚胎選擇。在以前人IVF中，主要是根據(jù)第2或第3天胚胎的形態(tài)學(xué)特征，來挑選優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植。卵裂期的胚胎一般根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，如卵裂球的數(shù)目，卵裂球的對稱性，胚胎的碎片程度等或其它的一些可見的特征分為幾個(gè)級別。所有的這些評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)都與胚胎的種植和懷孕有關(guān)，它雖然簡單易行，不損傷胚胎，但這些方法的總體成功率還是比較低的，因?yàn)橛?0%以上的移植胚胎沒有進(jìn)行種植[1]，仍存在一定的局限性。Mo

9、ntfoort(2004)指出，早期卵裂是獨(dú)立于胚胎細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞數(shù)之外的一種預(yù)示因子。為了提高選擇胚</p><p><b>　　1 資料與方法</b></p><p><b>　　1.1 一般資料</b></p><p>　　本研究材料包括體外受精—胚胎移植(IVFET)和胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的不孕癥患者1

10、29個(gè)周期,共1 032個(gè)正常受精的卵母細(xì)胞。平均年齡(31.1±3.4)歲。異常受精的卵母細(xì)胞(多原核或單原核)和取卵失敗以及取消移植的周期，均未納入本研究。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p><b>　　1.2.1 超排卵</b></p><p>　　采用長方案促排卵：月經(jīng)黃體

11、期(約周期第21天)使用GnRHa進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，在月經(jīng)的2～3d測E2、FSH、LH及B超監(jiān)測基礎(chǔ)竇卵泡，據(jù)激素水平及卵泡情況使用促排卵藥物，當(dāng)卵泡直徑達(dá)到18mm注射HCG，34～36h后在B超引導(dǎo)下取卵。</p><p>　　1.2.2 精子的準(zhǔn)備</p><p>　　精液樣品以手淫的方法收集于無菌的容器內(nèi)，液化后，對精液中精子密度、活動性及精子的形態(tài)進(jìn)行評估。根據(jù)精子的密度與活力

12、采用梯度離心(300g×8min)或直接上游等不同的方法進(jìn)行處理。經(jīng)睪丸穿刺獲得的睪丸組織經(jīng)洗滌后粉碎離心(300g×8min)，取沉淀精子備用。</p><p>　　1.2.3 體外受精(IVF)</p><p>　　經(jīng)陰道穿刺將卵—冠—丘復(fù)合物(OCCCs)取出后，用HTF清洗三遍后，置于HTF培養(yǎng)皿中(100μL/滴，含10%HSA)預(yù)培養(yǎng)，4～6h后放入受精液滴

13、中(100μL HTF/滴，含10% HSA)，每個(gè)液滴加入2 000～20 000條活動精子，放入37 ℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。</p><p>　　1.2.4 胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)</p><p>　　ICSI時(shí)，將洗滌好備用的精子加入5μL 10%的pvp微滴中，注射的卵母細(xì)胞置于5μL含10%HSA的MHTF微滴中，上面覆蓋石蠟油，用固定針在9點(diǎn)鐘的位置固

14、定卵母細(xì)胞，使極體位于6或12點(diǎn)的位置，以注射針吸取單個(gè)形態(tài)正常的活動精子，于3點(diǎn)的位置將精子注入卵母細(xì)胞內(nèi)，回吸少量胞漿以確保破膜，后緩慢退出注射針，釋放固定的卵母細(xì)胞，然后注射下一個(gè)，方法同上所述。</p><p>　　1.2.5 受精、原核形態(tài)學(xué)及原核構(gòu)型的評估</p><p>　　取卵4～6h后對成熟卵子進(jìn)行受精，16～18h后對卵母細(xì)胞的受精情況進(jìn)行檢查。在本研究中，當(dāng)有兩個(gè)清晰

15、的原核出現(xiàn)時(shí)，確認(rèn)為卵母細(xì)胞已受精。并對合子原核進(jìn)行評分[6]，同時(shí)評估原核與極體的構(gòu)型關(guān)系。</p><p>　　對原核構(gòu)型的評估采用如下方法：將合子置于覆蓋石蠟油的MHTF微滴中，用一根細(xì)玻璃管輕輕撥動使其旋轉(zhuǎn)，以便使極體位于6點(diǎn)鐘的位置且原核清晰可見，不重疊。這項(xiàng)操作總共不超過15s，且對胚胎不會造成損傷。對原核的構(gòu)型及形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析并記錄，在原核構(gòu)型的基礎(chǔ)上分為以下四種類型：PN1、PN2、PN3和PN

16、4。PN1型合子其構(gòu)型為兩原核位于10：20或03：50的位置，PN2型合子其構(gòu)型為兩原核位于01：40或08：10的位置，PN3型合子其構(gòu)型為兩原核位于06：00或12：30的位置，PN4型合子其構(gòu)型為兩原核位于02：45或09：15的位置。</p><p>　　在移植入子宮之前，我們對以上種類合子進(jìn)行進(jìn)一步的評估，分別對受精后24～26、48、72及120h后的胚胎發(fā)育進(jìn)行評估。根據(jù)第3天胚胎的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行

17、移植胚胎的選擇，在有多余可供選擇胚胎的前提下，盡可能選擇某一種原核構(gòu)型和早期卵裂的胚胎，后移入子宮，同時(shí)進(jìn)行黃體支持。</p><p>　　在移植后14d，對血hCG水平進(jìn)行測定，陽性者定為生化妊娠;移植后25～30d，在B超下鑒定是否有孕囊及胎心出現(xiàn)，均有則視為臨床妊娠。</p><p>　　1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析</p><p>　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)

18、差(Mean±SD)表示。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P&lt;0.05為差異顯著。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 四種不同構(gòu)型來源的胚胎早期卵裂、優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚率的比較</p><p>　　1 375個(gè)卵母細(xì)胞中,正常受精的有1 032個(gè)(除去未成熟、未受精及異常受

19、精的卵子)納入本研究。在IVF和ICSI病人之間，不同原核構(gòu)型的比例、受精、卵裂、優(yōu)胚率及種植懷孕率之間沒有顯著的差異。具體結(jié)果如表1所示,由表中可以看出:合子原核構(gòu)型主要有四種，依次為PN1(29.58%)，PN2(27.67%)，PN3(22.38%)及PN4(20.37%)。與PN2，PN3相比，PN1，PN4來源的胚胎其早期卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚率均顯著增加(P&lt;0.05),PN2和PN3之間差異均不顯著(P&a

20、mp;gt;0.05)。</p><p>　　2.2 原核構(gòu)型、早期卵裂與種植率和懷孕率之間的關(guān)系</p><p>　　不同原核構(gòu)型的合子，其早期卵裂率與種植率和懷孕率之間的關(guān)系如表2所示，由表中可以看出，與PN2、PN3構(gòu)型的合子相比，PN1和PN4構(gòu)型的合子其早期卵裂率顯著增高(P&lt;0.05),移植PN1、PN4構(gòu)型和早期卵裂的胚胎其種植率和懷孕率均顯著升高(P&

21、lt;0.05)。PN2和PN3之間各項(xiàng)差異均不顯著(P&gt;0.05)。表1 四種不同構(gòu)型來源的胚胎早期卵裂、優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚率的比較注：與PN2相比*P&lt;0.05，與PN3相比△P&lt;0.05表2 原核構(gòu)型、早期卵裂與種植率和懷孕率之間的關(guān)系注：與PN2相比*P&lt;0.05，與PN3相比△P&lt;0.05</p><p><b>　　3 討論&

22、lt;/b></p><p>　　胚胎在子宮中能否進(jìn)行著床并發(fā)育，取決于很多因素，包括胚胎質(zhì)量的好壞，子宮內(nèi)膜的容受性及胚胎的染色體倍性等遺傳學(xué)因素是否正常等[7]，選擇什么樣的胚胎進(jìn)行移植是關(guān)系到IVF成功與否的關(guān)鍵因素之一。因此，能夠預(yù)示胚胎發(fā)育潛力的一些標(biāo)準(zhǔn)變的越來越重要。因而有很多學(xué)者從多方面探索一些與胚胎發(fā)育和妊娠有關(guān)的因素，如受精卵原核的形態(tài)及核仁分布及多少，胚胎卵裂的時(shí)間，原核與極體的構(gòu)型關(guān)系

23、及是否出現(xiàn)胞漿暈，第3天8細(xì)胞胚胎的數(shù)量及胚胎的碎片程度等[8]。其中方叢(2006)研究表明移植早期卵裂胚胎可以提高IVFET的成功率，并提高妊娠率[9]。由于原核對胚胎的進(jìn)一步發(fā)育及種植和懷孕有一定的預(yù)示作用，所以在近來的一些研究中，原核的形態(tài)學(xué)引起了廣泛的關(guān)注。在卵裂之前，原核必須平行于極體[10]，因此我們可以推測原核的構(gòu)型對卵裂的發(fā)生一定存在某種作用，已報(bào)道在合子卵裂前，原核將向第二極體方向旋轉(zhuǎn)為合子卵裂做好準(zhǔn)備[11]。因

24、此，本實(shí)驗(yàn)通過原核構(gòu)型與早期卵裂來評估胚胎的質(zhì)量，以期提高試管嬰兒的效率。</p><p>　　在IVF中，精子從各種不同的方向穿透卵母細(xì)胞[12]，因此，雄原核與雌原核以不同分方式相互靠近，從而形成PN1、PN2、PN3和PN4四種不同的原核構(gòu)型。但在ICSI中，精子是被已固定的方向注入卵母細(xì)胞中的，即在3點(diǎn)的位置，卵子的極體則位于6或12點(diǎn)的位置。由于精子是被注射于卵母細(xì)胞的中心或稍偏里處，所以以ICSI方式

25、受精的所有卵母細(xì)胞應(yīng)該表現(xiàn)為同一原核構(gòu)型。然而，通過我們的觀察，事實(shí)卻并非如此。所有通過IVF或ICSI產(chǎn)生的合子，其原核構(gòu)型均表現(xiàn)出與以上四種相似的情形，且?guī)茁驶鞠嗤@些事實(shí)說明，合子原核構(gòu)型的類型與精子的穿透方向是沒有關(guān)聯(lián)的，因此可以將原核構(gòu)型作為評估胚胎發(fā)育潛能的指標(biāo)。在我們的研究中，平行于極體的PN1和PN4型合子，與PN2、PN3型相比，其受精或ICSI后24～26h胚胎的早期卵裂率顯著增高(P&lt;0.05)。

26、移植早期卵裂發(fā)育成的優(yōu)質(zhì)胚胎與晚期卵裂的優(yōu)胚相比，其種植率及懷孕率均顯著增高(P&lt;0.05)，這與國外的報(bào)道一致[1314],在原核消失和卵裂之間，對一部分不同構(gòu)型的合子每隔幾小時(shí)進(jìn)行觀察，并未發(fā)現(xiàn)原核構(gòu)型的改變。通過對動物合子的觀察發(fā)現(xiàn)，</p><p>　　本研究通過對原核構(gòu)型及胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛力的觀察，來評估原核構(gòu)型早期卵裂與胚胎發(fā)育、種植率和懷孕率之間的關(guān)系。提示臨床上移植有限的胚胎時(shí)，在

27、胚胎評分同樣的情況下,可采用合子原核構(gòu)型及早期卵裂為指標(biāo)來指導(dǎo)選擇植入胚胎。且該研究方法簡單，耗時(shí)少，對胚胎無損傷,對于選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，提高種植成活率和試管嬰兒效率有一定的意義。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　1 Scott L.Pronuclear scoring as a predictor of embryo dev

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