原核形態(tài)、卵裂胚發(fā)育與染色體異常的關(guān)系.pdf

1、在過(guò)去的二十多年里，體外受精—胚胎移植迅猛發(fā)展。妊娠率從早期非常低的水平發(fā)展到如今的40％左右。然而，這妊娠率直接和移植多個(gè)胚胎有關(guān)。移植多個(gè)胚胎是依據(jù)目前選擇胚胎移植的標(biāo)準(zhǔn)，胚胎移植后的種植率只有20％-30％。這意味著在移植到子宮內(nèi)的胚胎中，有近70％-80％是不能種植的，因此，為了保證一定水平的妊娠率，往往選擇2-3個(gè)胚胎移植。為了降低多胎妊娠率，有越來(lái)越多的國(guó)家制定嚴(yán)格的法規(guī)，控制移植胚胎數(shù)目。為此，我們應(yīng)該選擇最有發(fā)育潛能的胚

2、胎移植，減少移植胚胎的數(shù)目。 如今，選擇胚胎移植主要有形態(tài)學(xué)指標(biāo)、胚胎種植前診斷、囊胚培養(yǎng)、生化指標(biāo)等這幾種方法。其中，形態(tài)學(xué)指標(biāo)是目前最常用的方法，這是因?yàn)檫@種方法具有簡(jiǎn)單、快捷、無(wú)創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)。具體指標(biāo)包括：原核形態(tài)、第一次卵裂的時(shí)間、卵裂期胚胎的形態(tài)學(xué)及評(píng)分等。卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)的主要形態(tài)學(xué)參數(shù)有卵裂球的數(shù)目、大小、形狀、對(duì)稱(chēng)性、胞漿的形態(tài)、碎片的比例、有無(wú)多核細(xì)胞、細(xì)胞的緊密程度等，在臨床工作中根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)還建立了各種胚

3、胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)原核的形態(tài)能很好地預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能。目前主要有兩種原核評(píng)分體系。1998年Scott和Smith，根據(jù)原核和核仁的排列方式、胞漿的外觀、有無(wú)提前分裂，提出了他們的原核評(píng)分方法；根據(jù)分?jǐn)?shù)的高低選擇胚胎移植，當(dāng)原核評(píng)分>15分時(shí)，種植率為28％，分娩率為65％。1999年Tesarik和Greco將原核分為0-5型共6種類(lèi)型。其中0型原核為理想的形態(tài)，其它為不理想。0型原核胚胎發(fā)育停滯率為8.5％，而其它5種

4、類(lèi)型的原核發(fā)育停滯率為20％—31％。 為什么原核形態(tài)可以預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能？為什么結(jié)合原核評(píng)分和胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分選擇胚胎移植可以有更高的妊娠率和種植率？在近期的一些研究中發(fā)現(xiàn)原核形態(tài)和胚胎的染色體狀況有關(guān)，2002年Kahraman等根據(jù)原核中核仁前體的分布、原核的排列、胞漿的外觀對(duì)原核進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn)從評(píng)分高的原核發(fā)育而來(lái)的胚胎中染色體異常的比例低于原核評(píng)分低的胚胎；2003年Gamiz等研究了原核的形態(tài)和胚胎發(fā)育以及染色體的狀況

5、，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)原核大小相當(dāng)、核仁前體呈線(xiàn)性排列的合子發(fā)育到桑葚胚和囊胚的機(jī)會(huì)明顯增加，從這類(lèi)合子發(fā)育而來(lái)的胚胎染色體異常的機(jī)會(huì)明顯降低。Gianaroli等研究發(fā)現(xiàn)原核長(zhǎng)軸和極體的位置也影響胚胎的發(fā)育潛能和胚胎的染色體狀況，他們的研究發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的位置是極體和原核的長(zhǎng)軸垂直，其次是極體位于原核的長(zhǎng)軸上，其余的20％為極體位于原核長(zhǎng)軸的不同角度；其中由α型原核發(fā)育而來(lái)的胚胎有86％達(dá)到可利用的標(biāo)準(zhǔn)，β型為83％，均非常顯著地高于γ型的57％；經(jīng)

6、FISH分析后，由α型原核發(fā)育而來(lái)的胚胎有36％是正常的，β型為33％，二者均非常顯著地高于γ型的7％。2004年Balaban等根據(jù)Tesarik和Greco的原核評(píng)分體系對(duì)原核的評(píng)分與胚胎發(fā)育、胚胎的染色體狀況進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從0型原核發(fā)育而來(lái)的胚胎非整倍體率為25.6％，而從一個(gè)或兩個(gè)形態(tài)異常原核發(fā)育而來(lái)的胚胎的這一比例分別為73％和83％。 從目前的研究結(jié)果來(lái)看，原核形態(tài)、胚胎發(fā)育與胚胎染色體狀況有一定的關(guān)系，但相關(guān)的

7、研究資料并不多，特別是對(duì)原核評(píng)分與胚胎染色體的狀況之間的關(guān)系的研究，全世界相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道只有5篇左右，國(guó)內(nèi)很少見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。全世界關(guān)于原核排列、核仁分布、胞漿外觀與胚胎發(fā)育以及胚胎染色體狀況的研究只有2002年Kahraman的一篇報(bào)道，并且在Kahraman的研究中，精子來(lái)源于嚴(yán)重不育的男性，因此，代表性有一定的局限。本研究的目的是通過(guò)研究原核形態(tài)、胚胎發(fā)育與染色體異常的關(guān)系，尋找目前臨床上常見(jiàn)的一些原核、胚胎形態(tài)學(xué)現(xiàn)象背后的本質(zhì)，并

8、試圖尋找原核形態(tài)、胚胎發(fā)育與染色體異常之間的規(guī)律，如果有規(guī)律可循，可以應(yīng)用這些規(guī)律來(lái)指導(dǎo)我們的日常工作。本研究包括兩部分內(nèi)容，第一部分是用13、18、21、X、Y五色探針同時(shí)檢測(cè)植入前人胚胎非整倍體，目的是建立用13、18、21、X、Y五色探針?lè)治鰡蝹€(gè)卵裂球的方法。第二部分研究原核形態(tài)、胚胎發(fā)育與染色體異常的關(guān)系。 第一部分用13、18、21、X、Y五色探針檢測(cè)植入前人胚非整倍體的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 建立同時(shí)用13

9、、18、21、X、Y五色探針用于分析單個(gè)卵裂球的方法。 方法： 收集IVF/ICSI治療周期中受精后第三天，不適宜移植和冷凍的正常受精胚胎11個(gè)、雙精受精胚胎1個(gè)用于研究。用Tyrode's酸溶解這些胚胎的透明帶，用0.1％Tween-20/0.01 N HCL將卵裂球固定，用Vysis公司的MultiVysion PGTFISH探針進(jìn)行分析。 結(jié)果： 12個(gè)胚胎共有46個(gè)卵裂球，有核的卵裂球43個(gè)，其中

10、有3個(gè)卵裂球各有2個(gè)核，共有46個(gè)細(xì)胞核。成功固定45個(gè)核，固定成功率為97.8％。43個(gè)核有雜交信號(hào)，雜交率為95.6％，有2個(gè)核因?yàn)樘旅?，沒(méi)有雜交信號(hào)。 11個(gè)單精受精胚胎共有39個(gè)核有信號(hào)，都為二倍體胚胎，其中正常胚胎2個(gè)；在9個(gè)異常胚胎中，嵌合型胚胎6個(gè)，異常非嵌合型胚胎2個(gè)，無(wú)規(guī)律分離型1個(gè)。在39個(gè)核中，異常核19個(gè)，所占比例為48.7％。其中簡(jiǎn)單異常14個(gè)，占異常核的73.7％；復(fù)雜異常5個(gè)，占26.3％。最常見(jiàn)

11、的異常是13單體，有6個(gè)，占所有核的15.4，占異常核的31.6％；其次是21三體，有5個(gè)，占所有核的12.8％，占異常核的26.3％。在5種染色體中，13號(hào)和21號(hào)染色體出現(xiàn)異常的頻率最高，均為39.1％。1個(gè)多精受精的胚胎表現(xiàn)為無(wú)規(guī)律分離型。 第二部分原核形態(tài)、卵裂胚發(fā)育與染色體異常的關(guān)系 目的： 探討原核形態(tài)、卵裂胚發(fā)育與染色體異常的關(guān)系。 方法： 2005年9月—2006年3月對(duì)因?yàn)榉磸?fù)胚

12、胎種植失敗、不明原因的早期習(xí)慣性流產(chǎn)需要行PGD的病人7例，用13、18、21、X、Y五色探針篩查這些病人種植前胚胎的非整倍體，同時(shí)觀察原核評(píng)分、胚胎發(fā)育與胚胎染色體異常的關(guān)系。 結(jié)果： 1.7個(gè)病人各行PGD一周期，共獲卵子101個(gè)，正常受精卵子78個(gè)，受精率77.2％；有73個(gè)正常受精的卵子分裂，卵裂率93.6％；優(yōu)質(zhì)胚胎27個(gè)，共有52個(gè)胚胎達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)，有51個(gè)胚胎有診斷結(jié)果，經(jīng)FISH分析為正常的胚胎22個(gè)，正

13、常胚胎的比例為43.1％；異常胚胎29個(gè)，其中非整倍體胚胎28個(gè)，所占比例為54.9％，三倍體胚胎1個(gè)。有6個(gè)病人有胚胎移植，共移植胚胎15個(gè)，冷凍4個(gè)胚胎，有一個(gè)病人單胎妊娠。 2.由原核評(píng)分≥14分的合子發(fā)育而來(lái)的胚胎49個(gè)，為A組；<14分的胚胎24個(gè)，為B組。A組中，碎片比例≤20％的胚胎所占比例為51％，顯著高于B組的25％，P<0.05。A組卵裂球大小均勻的胚胎占65.3％，顯著高于B組的33.3％，P<0.05。在

14、A組胚胎中，≥6細(xì)胞期胚胎有32個(gè)，所占的比例為65.3％，顯著高于B組的33.3％，P<0.05。在A組胚胎中優(yōu)質(zhì)胚胎的比例為46.9％，顯著高于B組胚胎的20.8％，P<0.05。在有FISH診斷結(jié)果、原核評(píng)分≥14分的37個(gè)胚胎中，正常胚胎的比例為51.4％，高于原核評(píng)分<14分胚胎的21.4％，P<0.05。 3.隨著碎片比例的增加，正常胚胎的比例下降，胚胎的染色體狀況和碎片比例有密切的相關(guān)性(r=0.835，P<0.0

15、1)。 4.8細(xì)胞胚胎中，經(jīng)FISH分析正常的胚胎比例為55％，顯著高于7細(xì)胞以下胚胎的30.4％，P<0.05；高于8細(xì)胞以上胚胎的比例為50％(4/8)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；8細(xì)胞以上胚胎中正常胚胎的比例高于7細(xì)胞以下胚胎(30.4％)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。 5.在卵裂球數(shù)目為偶數(shù)的胚胎中，F(xiàn)ISH正常的胚胎比例為48.4％(15/31)，在卵裂球數(shù)目為奇數(shù)的胚胎中，正常胚胎的比例為35％(7/2

16、0)，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，P>0.05。在卵裂球大小均勻的胚胎中，染色體正常胚胎所占比例為54.8％(17/31)；卵裂球大小不均勻的胚胎中，正常胚胎所占比例為25％，顯著低于卵裂球均勻組，P<0.05。 6優(yōu)質(zhì)胚胎中，正常胚胎的比例為55.6％，顯著高于非優(yōu)質(zhì)胚胎的29.2％，P<0.05。原核評(píng)分≥14分的優(yōu)質(zhì)胚胎20個(gè)，其中正常胚胎的比例為70％，雖然高于優(yōu)質(zhì)胚胎的55.6％，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 小結(jié)：

17、 1.在種植前胚胎中，染色體異常胚胎廣泛存在，其中非整倍體胚胎占染色體異常胚胎的絕大多數(shù)。 2.原核評(píng)分高的胚胎有更好的發(fā)育潛能，其原因是因?yàn)樵嗽u(píng)分高的胚胎染色體正常的比例高。 3.隨著胚胎碎片比例的提高，胚胎發(fā)生染色體異常的機(jī)會(huì)增加，胚胎的染色體狀況和碎片比例有密切的相關(guān)性。 4.受精后第3天的胚胎發(fā)育到8細(xì)胞是一種理想的發(fā)育速度，這些胚胎中染色體正常的比例，顯著高于7細(xì)胞以下的胚胎，高于9細(xì)胞以上的