脂多糖(LPS)對斑馬魚胚胎發(fā)育影響機(jī)制的初步研究.pdf

1、斑馬魚是一個(gè)非常重要的發(fā)育生物學(xué)和免疫生物學(xué)模式生物，利用斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對象，研究人類疾病病理過程，對于揭示脊椎動物發(fā)育和人類疾病致病機(jī)理等方面都有著非常重要的學(xué)術(shù)意義。
　　 LPS在哺乳動物中誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并可導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，包括胚胎吸收、IUFD(intra-uterine fetal death)、IUGR(intra-uterine growth restriction)、早產(chǎn)和流產(chǎn)。但是LPS影響胚胎發(fā)育的機(jī)制

2、尚不確定，本論文利用斑馬魚開展發(fā)育學(xué)研究的優(yōu)勢研究LPS影響胚胎發(fā)育的作用機(jī)理。
　　 本論文在本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)LPS刺激斑馬魚胚胎誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，建立了LPS刺激斑馬魚胚胎的技術(shù)方法，即將LPS(5mg/ml)純組分顯微注射到sphere時(shí)期的斑馬魚胚胎的動物極細(xì)胞間隙，可以引發(fā)大約72％的胚胎發(fā)育缺陷，在bud時(shí)期，LPS刺激的胚胎首次表現(xiàn)出發(fā)育上的異常，相對于只用PBS刺激的對照組，顯微注射了LPS的實(shí)驗(yàn)組胚胎的

3、縱向中軸被明顯拉長，后期的發(fā)育過程中主要表現(xiàn)為脊椎發(fā)育異常、體節(jié)分化異常、尾部生成缺陷等。為了進(jìn)一步研究LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的機(jī)制，我們建立了LPS刺激前后斑馬魚胚胎的差減文庫來尋找LPS刺激誘導(dǎo)差異表達(dá)的基因。
　　 通過分析差減文庫的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了Notch通路的多個(gè)基因(Her6，Her9，DeltaD)，說明Notch通路可能被異常調(diào)控，進(jìn)一步用RT-PCR檢測Notch家族靶基因在LPS刺激前后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)對胚

4、胎發(fā)育有重要功能的Notch家族多個(gè)靶基因(Her1，Her4，Her6，Her7，Her9)在LPS刺激前后表達(dá)變化異常。在LPS刺激后直到首次出現(xiàn)表型的bud時(shí)期，Notch通路多個(gè)靶基因被明顯的下調(diào)。
　　 以上結(jié)果提示Notch信號可能參與了LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的過程，已有文獻(xiàn)報(bào)道LPS可以通過NF-kB的激活上調(diào)iNOS表達(dá)，據(jù)此我們提出了LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的作用機(jī)制假說：LPS通過TLR4激活了NF-kB，進(jìn)而

5、上調(diào)iNOS和NO的水平，過量的NO分子抑制了Notch-IC的置換過程而下調(diào)了Notch信號，造成一系列靶基因的表達(dá)下調(diào)，繼而影響了胚胎發(fā)育。
　　 為了證實(shí)以上假說，本論文從多方面反復(fù)論證。iNOS活性的檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS刺激后30分鐘胚胎的iNOS活性相對對照組提高了3.28倍，此時(shí)如果使用iNOS特異性抑制劑1400w可以挽救34％實(shí)驗(yàn)組胚胎的缺陷。在斑馬魚胚胎的培養(yǎng)液中添加Notch信號的特異性抑制劑DAPT，可以重復(fù)

6、出部分由LPS注射引發(fā)的發(fā)育缺陷。原位雜交結(jié)果證實(shí)，DAPT刺激下，Hariy-related家族基因(Notch信號中的下游效應(yīng)基因)的表達(dá)被抑制。過表達(dá)zNotchl-IC(Notch受體胞內(nèi)區(qū)部分，在Notch信號傳遞過程中Notch-IC從膜上被水解后進(jìn)入核內(nèi)激活下游信號)可以挽救20％由LPS引發(fā)的發(fā)育缺陷。以上數(shù)據(jù)初步證明我們提出的關(guān)于LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形作用機(jī)制假說。
　　 另外，為了確定LPS在斑馬魚中的識別方

7、式是否類似哺乳動物，可特異的結(jié)合TLR4并誘發(fā)下游iNOS上調(diào)表達(dá)，我們分別在胚胎中注射zTLR4amorpholino(MO)和zTLR4b MO。胚胎分裂期注射zTLR4a MO引發(fā)了嚴(yán)重的發(fā)育畸形，可導(dǎo)致胚胎48小時(shí)內(nèi)死亡，據(jù)此我們無法判斷zTLR4a是否參與了LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的過程。另一方面，胚胎分裂期注射zTLR4b MO沒有引發(fā)胚胎發(fā)育上的異常，且可以挽救13％的LPS刺激后被誘發(fā)發(fā)育缺陷的胚胎，證明zTLR4b參與了

8、LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形過程。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作顯示在各種革蘭氏陰性菌粗毒素刺激條件下成體斑馬魚中zTLR4b的基因表達(dá)上調(diào)幅度明顯高于zTLR4a，暗示zTLR4b在斑馬魚天然免疫中起著重要的作用。
　　 綜上所述，我們推測，LPS可能通過了TLR4通路，iNOS，NO，和Notch通路協(xié)同作用誘發(fā)了胚胎發(fā)育異常，TLR4b參與了這個(gè)過程。zTLR4a和zTLR4b可能分別側(cè)重不同的生物學(xué)功能，前者側(cè)重于發(fā)育功能，