KSHV編碼vGPCR對斑馬魚胚胎早期發(fā)育的影響.pdf

1、卡波氏肉瘤(KS)是艾滋病患者常見的高致死性血管增生型腫瘤?？úㄊ先饬鱿嚓P皰疹病毒(KSHV)是KS的直接病因，該病毒基因組編碼的G-蛋白偶聯(lián)受體(vGPCR)是已知的幾個KSHV致瘤蛋白之一，此蛋白與KSHV相關惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。vGPCR在細胞中的表達能夠激活多條信號通路和影響諸多轉錄因子從而增加促炎癥細胞因子和血管生成細胞因子的生成。vGPCR在裸鼠中表達能夠引起裸鼠產(chǎn)生腫瘤，轉vGPCR基因小鼠也能形成類似人類KS的病變。

2、
　　斑馬魚是一種重要的模式生物，在胚胎發(fā)育機制的研究及各種人類疾病研究中得到了廣泛的應用。斑馬魚作為人類病毒研究的模式生物罕見報道，目前尚未有采用斑馬魚來研究KHSV的研究報道。本研究首次采用斑馬魚來對KHSV中致癌基因vGPCR進行研究，鑒定vGPCR對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響。
　　本研究采用顯微注射法將vGPCR基因導入斑馬魚受精卵;利用形態(tài)學觀察、mRNA水平表達檢測、血管生成定量分析和血管染色法分析vGPCR對斑

3、馬魚早期胚胎發(fā)育的影響。本論文研究內容和研究結果如下:
　　1.以FRT/TO-cDNA5載體和CDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體為基礎構建了表達vGPCR的重組質粒CDH-CMV-HA-vGPCR-EF1-copGFP;
　　2.通過磷酸鈣轉染法將CDH-CMV-HA-vGPCR-EF1-copGFP轉入HEK293T細胞，并進行免疫印跡雜交檢測，結果顯示該重組質粒能夠在細胞內成功表達目的蛋白;
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4、.采用顯微注射技術將CDH-CMV-HA-vGPCR-EF1-copGFP導入斑馬魚受精卵，統(tǒng)計結果表明注射vGPCR的實驗組胚胎存活率為50.80％，GFP表達率為53.58％;注射空載體的對照組胚胎存活率為55.02％，GFP表達率為48.16％。形態(tài)學檢測結果顯示，注射vGPCR的胚胎與對照組的發(fā)育進程基本一致，vGPCR對斑馬魚胚胎早期形態(tài)發(fā)育未產(chǎn)生明顯影響;對注射了vGPCR并表達GFP的胚胎進行RT-PCR檢測，結果顯示vG

5、PCR在斑馬魚胚胎中存在較低水平的mRNA表達;
　　4.利用堿性磷酸酶定量檢測法對vGPCR注射組斑馬魚胚胎和對照組胚胎分別進行分析，結果表明兩組胚胎的堿性磷酸酶含量相差不大，表明vGPCR對斑馬魚早期胚胎血管生成總量無明顯影響;
　　5.對注射vGPCR后72小時的胚胎血管進行堿性磷酸酶染色，觀察到斑馬魚胚胎新生血管發(fā)育受到了不同程度的影響，主要為腸下靜脈扭曲與血管排布紊亂，說明vGPCR能夠造成斑馬魚胚胎早期血管發(fā)育畸