Tenascin基因與斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的關(guān)系.pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是一類嚴重危害人類健康的先天畸形，其發(fā)生與心肌細胞和/或心臟特異傳導(dǎo)細胞的異常分化、遷移等密切相關(guān)。細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及其受體在此過程中所起的重要的介導(dǎo)作用，已成為當(dāng)前先天性心臟病病因研究領(lǐng)域的熱點之一.Tenascin(TN)是一類存在于脊椎動物細胞外基質(zhì)中的具高度保守性結(jié)構(gòu)的寡聚體糖蛋白家族，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)黏附狀態(tài)和基質(zhì)

2、間相互作用來促進細胞遷移、增殖和分化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四種TN的家族成員-C、-W、-x、-R。TNC是該家族中研究得最多的，不僅在胚胎發(fā)育時期有重要的作用，在成體病理狀態(tài)下，如組織損傷、腫瘤等，也具有重要的功能。TNC與心臟病理狀態(tài)也有密切聯(lián)系，在人類動脈粥樣硬化、心肌梗死、擴張性心肌病、心肌炎等疾病中均有作用，但TNC在心臟異常發(fā)育中的作用，國內(nèi)外尚未有報導(dǎo)。 斑馬魚體外受精、胚胎透明、發(fā)育早期不依賴于有功能的血液循環(huán)，因此，有

3、利于心臟觀察和操作，本研究用斑馬魚為模型，通過原位雜交、RT-PCR技術(shù)檢測tenascin-c(tnc).tenascin-w(tnw)和tenascin-r(tnr)在斑馬魚不同發(fā)育階段的時空表達規(guī)律；予乙醇處理斑馬魚胚胎，觀察處理后心臟形態(tài)的變化，并用原位雜交的方法檢測tnc在心臟異常發(fā)育時表達的變化；予視黃酸、視黃醛脫氫酶抑制劑(DEAB)處理胚胎，并予顯微注射的方法過表達tnc.hand2基因，結(jié)合原位雜交的方法以發(fā)現(xiàn)tnc與

4、視黃酸信號及心臟發(fā)育的關(guān)系，從而為先天性心臟病的發(fā)病機制提供線索。 第一部分：tnc、tnw和tnr基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時空表達規(guī)律目的觀察tnc、tnw和tnr在斑馬魚發(fā)育過程中詳細的時空表達規(guī)律。 方法：選擇2hpf(hours post fertilization，受精后2小時)、4hpf,8hpf、10hpf,24hpf,48hpf,72hpf及7dpf(受精后7天)的斑馬魚，提取各個時期總RNA作RT-PC

5、R，并固定各個時期胚胎作原位雜交，觀察不同時期tnc、tnw和tnr在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時空表達。 結(jié)果：tnc、tnw和tnp在斑馬魚2hpf-10hpf時無表達，在24hpf,48hpf、72hpf及7dpf有表達。tnc主要表達在斑馬魚咽弓、脊索、體節(jié)、聽囊、胸鰭及后腦；tnw主要表達在咽弓、中腦、后腦、體節(jié)、脊索及聽囊；tnr專一地表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中。 結(jié)論：tnc和tnw在斑馬魚胚胎發(fā)育時期具有

6、特異性時空表達規(guī)律，二者在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中有密切聯(lián)系；tnr在斑馬魚胚胎中特異地表達在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中，可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的標志。三者在斑馬魚心臟正常發(fā)育過程中未檢測到表達。 第二部分：乙醇誘導(dǎo)tnc基因在斑馬魚胚胎心臟中表達目的觀察不同濃度乙醇對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響，探討妊娠期乙醇暴露導(dǎo)致胎兒心血管畸形的相關(guān)機制，建立心臟異常發(fā)育模型，進而觀察tnc基因在斑馬魚胚胎心臟異常發(fā)育過程中的表達變化。方法選擇斑馬魚囊胚

7、期(3hpf)、原腸期(5.7hpf)、體節(jié)期(18hpf)、咽囊期(24hpf)四個不同胚胎發(fā)育時間點，用不同濃度乙醇(100、200、300、400和500mM)持續(xù)處理斑馬魚胚胎，待胚胎發(fā)育至48hpf和72hpf時在解剖顯微鏡下實時觀察斑馬魚心臟的發(fā)育；用200mM濃度乙醇短時處理5hpf胚胎至18hpf，待胚胎發(fā)育至48hpf和72hpf時觀察心臟的發(fā)育；用RT-PCR及原位雜交的方法檢測乙醇對nkx2.5基因表達的影響；用R

8、T-PCR和原位雜交方法檢測tnc在斑馬魚異常發(fā)育時表達的變化。 結(jié)果：300mM及以上濃度的乙醇持續(xù)處理導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)包括心臟在內(nèi)的多系統(tǒng)畸形；200mM乙醇持續(xù)暴露僅引起心臟環(huán)化異常，而200mM乙醇短時暴露并不引起心臟發(fā)育畸形；RT-PCR及原位雜交結(jié)果顯示乙醇處理組nkx2.5基因的表達明顯上調(diào)；100mM至400mM乙醇處理的胚胎，在48hpf觀察時紉tnc在斑馬魚心臟部位均有表達。 結(jié)論：乙醇影響斑馬魚心

9、臟發(fā)育有濃度依賴性和嚴格的時間窗，囊胚期和原腸胚期為乙醇干擾心臟環(huán)化的關(guān)鍵時期；200mM乙醇在此期間持續(xù)處理的斑馬魚胚胎可以作為研究心臟環(huán)化機制的模型；乙醇可能是通過誘導(dǎo)nkx2.5的表達而影響心臟環(huán)化；tnc在斑馬魚心臟異常發(fā)育中有表達，可能對心臟的正常發(fā)育起保護作用；tnc在病理狀態(tài)下的表達模式不僅在脊椎動物中具有保守性，且在胚胎和成體時期均具有保守性。 第三部分：tenascin-c基因與視黃酸信號在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育中

10、的作用目的觀察tnc基因在視黃酸信號變化時的表達變化，以及其與心臟發(fā)育相關(guān)基因hand2的相互關(guān)系，從而揭示tnc與視黃酸信號胚胎心臟發(fā)育中的作用，為先天性心臟病的發(fā)病機制提供線索。 方法：予視黃酸及視黃醛脫氫酶抑制劑(DEAB)分別處理斑馬魚胚胎，另予顯微注射嗎啡啉RNA(morphonino)的方法抑制視黃醛脫氫酶(raldh2)的表達，隨后用原位雜交的方法觀察經(jīng)處理后的斑馬魚胚胎的形態(tài)變化以及tnc在心臟部位的表達變化；予

11、顯微注射在斑馬魚中過表達tnc基因，實時觀察斑馬魚胚胎發(fā)育的過程，并予原位雜交檢測gata5.hand2.gata4等基因的表達變化；用顯微注射在斑馬魚胚胎過表達hand2基因，并予原位雜交檢測tnc基因的表達變化。 結(jié)果：用視黃酸處理的斑馬魚胚胎，在72hpf并未觀察到tnc在心臟部位表達，予視黃醛脫氫酶抑制劑處理的斑馬魚胚胎，在72hpf觀察發(fā)現(xiàn)tnc在心臟部位表達明顯上調(diào)；用顯微注射抑制視黃醛脫氫酶Raldh2的表達，抑制

12、視黃酸信號后，同樣發(fā)現(xiàn)tnc在斑馬魚心臟部位表達上調(diào)；顯微注射過表達tnc基因后，在顯微鏡下觀察并未發(fā)現(xiàn)斑馬魚形態(tài)變化，原位雜交的方法也并未發(fā)現(xiàn)hand2.gata5.gata4基因的變化；顯微注射過表達hand2基因后，斑馬魚心臟發(fā)育明顯異常，同時觀察到tnc在心臟部位的表達上調(diào)。 結(jié)論：抑制視黃酸信號后，tnc基因表達上調(diào)，說明視黃酸是tnc的上游調(diào)節(jié)信號，控制著tnc的表達；tnc過表達后，并未見心臟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化；而