FoxO3基因在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中的功能研究.pdf

1、胚胎發(fā)育過程中,神經(jīng)發(fā)育是一個(gè)很復(fù)雜的事件,包括各種信號(hào)傳導(dǎo)的相互作用。本課題以斑馬魚的胚胎發(fā)育系統(tǒng)作為模型,采用“功能缺失”和“功能獲得”的方法初步研究了FoxO3在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程的功能作用。
　　 FoxO3是叉頭盒(forkhead)轉(zhuǎn)錄因子中O亞家族成員,在生物體內(nèi)參與多種生理調(diào)控作用,包括糖代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期阻滯、壓力耐受性、生物長壽控制及細(xì)胞凋亡等。然而,并不清楚其是否參與胚胎神經(jīng)發(fā)育。
　　 首先,

2、通過RT-PCR、整胚原位雜交及免疫組化方法檢測(cè)了斑馬魚FoxO3a基因的組織表達(dá)特征及胚胎發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)方式。結(jié)果顯示:FoxO3a在斑馬魚成體組織如腦、眼、肝、鰓、卵巢、精巢、腸、心臟、脾臟都有表達(dá)而在肌肉和鰾不能或極微弱表達(dá)；在胚胎發(fā)育時(shí)期中,FoxO3a的轉(zhuǎn)錄本最早出現(xiàn)于卵裂早期(1-8細(xì)胞期),隨后在囊胚晚期(4 hpf)上升到較高水平,且在受精后4-8小時(shí)間保持一個(gè)較高的表達(dá)。其后,表達(dá)逐漸下降并維持一個(gè)相對(duì)較低水平；為

3、了確定FoxO3a在胚胎中的表達(dá)部位,進(jìn)行了不同發(fā)育時(shí)期的胚胎整胚原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示:FoxO3a主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),尤其在前腦、中腦、中后腦邊界、后腦及視網(wǎng)膜部位表達(dá)更加明顯。
　　 采用反義morpholino(MO)敲降技術(shù),斑馬魚FoxO3a被8ng FoxO3a-MO的敲降可引起胚胎神經(jīng)發(fā)育的缺陷,且異?？杀籉oxO3a mRNA顯微注射挽救。通過吖啶橙(acridine orange,AO)和TU

4、NEL檢測(cè)進(jìn)一步證明FoxO3a的敲降誘導(dǎo)了一個(gè)增加的神經(jīng)凋亡；采用熒光定量PCR和胚胎原位雜交方法進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn):FoxO3a的敲降導(dǎo)致胚胎發(fā)育晚期神經(jīng)分子標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)且改變了凋亡相關(guān)分子的表達(dá)。
　　 為了進(jìn)一步研究FoxO3a調(diào)控胚胎神經(jīng)發(fā)育的分子機(jī)制,構(gòu)建了FoxO3a-A3突變體(將可能受PI3k/Akt信號(hào)磷酸化調(diào)控的三個(gè)保守的Ser/Thr位點(diǎn)分別用Ala替換)。比較分析了過量表達(dá)FoxO3a-A3突變體mRNA

5、與FoxO3a mRNA后的胚胎發(fā)育表型,結(jié)果顯示,400 Pg FoxO3a—A3 mRNA顯微注射后的胚胎死亡數(shù)目高于同劑量FoxO3a mRNA注射對(duì)照組。
　　 對(duì)脊椎動(dòng)物FoxO家族蛋白同源進(jìn)化分析表明:在斑馬魚中存在兩個(gè)與哺乳動(dòng)物FoxO3a同源的蛋白(FoxO3a與FoxO3b)。因此,還檢測(cè)了斑馬魚FoxO3b胚胎時(shí)空表達(dá)模式,結(jié)果顯示,FoxO3b與FoxO3a都集中在神經(jīng)系統(tǒng)部位表達(dá)。
　　 對(duì)Fox

6、O3b進(jìn)行反義MO敲降,結(jié)果表明,6 ng FoxO3b—MO注射引起相似于FoxO3a敲低后的表型異常。最后,當(dāng)共注射FoxO3b-MO與FoxO3a—MO時(shí),則僅需4 ng混合MOs(2ng Foxo3a-MO+2 ng Foxo3b-MO)導(dǎo)致胚胎神經(jīng)發(fā)育缺陷。進(jìn)而通過熒光定量PCR法進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FoxO3a與FoxO3b共敲降后顯著抑制了神經(jīng)分子標(biāo)志物的表達(dá),且誘導(dǎo)了凋亡基因Bim的強(qiáng)烈表達(dá)。最后,采用Western blot